Isolamento e gravações de canais Kv em Murino cardiomiócitos atriais e ventriculares

Resumo

Kv canal disfunção está associada a arritmias cardíacas. Para estudar os mecanismos moleculares que conduzem à ocorrência de arritmias tais que utilizam um protocolo sistemático para o isolamento dos cardiomiócitos atriais e ventriculares do canal Kv auxiliares ratinhos knockout de subunidade. Cardiomiócitos isolados podem então ser imediatamente utilizados para celulares estudos eletrofisiológicos, bioquímicos ou imunofluorescência (IF) ensaios.

Resumo

KCNE genes codificam para uma pequena família de subunidades de canais Kv auxiliares que formam complexos heteroméricos com subunidades alfa dos canais Kv para modificar as suas propriedades funcionais. Mutações em genes KCNE foram encontrados em pacientes com arritmias cardíacas, tais como a síndroma de QT longo e / ou fibrilação atrial. No entanto, a fisiopatologia molecular preciso que conduz a estas doenças permanece elusiva. Em estudos anteriores, as propriedades eletrofisiológicas da doença que causa mutações nestes genes têm sido mais estudada em sistemas de expressão heterólogos e não podemos ter certeza se os efeitos relatados podem ser diretamente traduzidos em cardiomiócitos nativos. Em nosso laboratório, portanto, usar uma abordagem diferente. Nós estudar diretamente os efeitos da KCNE deleção do gene em cardiomiócitos isolados de camundongos knockout por eletrofisiologia celular - uma técnica única que descrevemos nesta edição do Jornal de Experimentos visualizado. Os corações de geneticaratinhos KCNE lly modificadas são rapidamente excisado e montado num aparelho de Langendorff por canulação. Grátis Ca ^{2 +} no miocárdio está vinculado por EGTA, e dissociação de miócitos cardíacos é então obtida por perfusão retrógrada das artérias coronárias com um baixo Ca ² especializado colagenase tampão contendo ^+. Átrios, parede livre do ventrículo direito e no ventrículo esquerdo pode, então, ser separados por técnicas microcirúrgicas. O cálcio é então adicionado lentamente de volta para cardiomiócitos isolados em um passo múltiplo compreendendo procedimento de lavagem. Cardiomiócitos atriais e ventriculares de aparência saudável sem contracções espontâneas são então imediatamente sujeitas a análises eletrofisiológicas pela técnica patch clamp ou outras análises bioquímicas dentro das primeiras 6 horas após o isolamento.

Protocolo

1. Anestesia animal e extração de órgãos

1. Anestesiar o rato por injeção intraperitoneal (ip) de cetamina (200 mg / kg de peso corporal) e xilazina (20 mg / kg de peso corporal).
2. Para anticoagulate injetar 250 ip UI de heparina para evitar a formação de coágulos sangüíneos e trombo.
3. Espere até narcose profunda é atingido, o qual é caracterizado por arreflexia. Para verificar arreflexia reflexo teste, córnea por tocar suavemente a córnea ou reflexo voo de teste por beliscar a cauda.
4. Transferir o mouse para mesa de operação e corrigi-lo em posição supina.
5. Faça uma incisão na pele ea parede abdominal abaixo do xifóide e toracotomia garra: estender o corte para ambos os lados ao longo do arco costal e posteriormente cortado costelas na linha axilar média, desviar para cima da caixa torácica.
6. Abra pericárdio, localizar grandes vasos. Pressione suavemente caudal coração, para melhor visualizar a aorta. Grampo da aorta com a pinça.
7. Colocar o coração no concavidade de um par de s cissors e dissecar todos os navios de conexão com um único corte. Certifique-se de preservar uma parte suficientemente grande da aorta ascendente para a canulação Langendorff.
8. Transferir coração excisado imediatamente para uma placa de Petri cheia de gelo frio e pré-oxigenado solução 1 (para soluções, ver Tabela 1).

2. Preparação de perfusão do coração e Langendorff

1. Canular a aorta, com uma cânula de aço 1.8F. Certifique-se de evitar a embolia aérea.
2. Fixar a cânula na aorta, com uma sutura cirúrgica e coronárias, lave com 1 ml de solução 1.
3. Ligue cânula com um aparelho de Langendorff.
4. Certifique-se de tempo a partir de toracotomia para canulação Langendorff não excede 120 s, para evitar lesão de isquemia / reperfusão prolongada para o miocárdio.
5. Coração perfundir com 10 ml de solução de Ca ^{2 +} 2 livre (4 ml / min).
6. Coração perfundir com colagenase solução 3 para 8 min (4 ml / min).

le "> 3. Microsurgical Dissociação de Cardíaco Chambers

1. Transferir para um centro de pré-aquecido placa de Petri de 100 mm contendo Ca ^{2 +} baixo solução 4.
2. Remova cuidadosamente aórtica e outros tecidos não-cardíaca com tesoura e descartá-lo.
3. Átrios e ventrículos separados e continuar com cada câmara separadamente. Manter as células imersas em solução 4. Use volumes pequenos (menos de 5 ml).

4. Dissociação adicional de cardiomiócitos

1. Cardiomiócitos atriais:
   1. Para individualizar cardiomiócitos atriais transferir os átrios em um prato separado cultura pré-aquecido de 100 mm e dissociar o tecido através puxando-o distante com uma pinça fina. Assegurar uma dissociação quase completa do tecido.
   2. Usar uma pipeta de 1 ml com uma ponta de pipeta alargada fogo polida plástico para suspender as células em 1 ml de solução a 5 por 5 min.
   3. Separa-se as células a partir de detritos por meio de um filtro celular (200 malhagem jim).
   4. Adicionar 5 ml de solução de 5 a suspensão de células e centrifugação durante 2 min a 16 xg à temperatura ambiente.
   5. Os passos seguintes são operados sob uma capa de cultura de células. Descartar o sobrenadante e re-suspensão do sedimento em 5 ml de uma solução de 6.
   6. Após a sedimentação por acção da gravidade, durante 10 minutos em um tubo de 15 ml e centrifugar durante 1 min a 16 xg à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante. Re-suspender as células, dependendo da sua quantidade em 1-5 ml de uma solução de 6.
2. Cardiomiócitos ventriculares:
   1. Dissecar a região ventricular esquerda de interesse com uma pinça fina em 5 ml de solução 4.
   2. Suspender as células por pipetagem suave até que a maioria das células são separadas. Transferir a solução de células após a filtragem (200 malhagem um) para um tubo de 50 ml, adicionar um volume de 25 ml.
   3. Centrifugar durante 2 minutos a 16 xg à temperatura ambiente.
   4. Os passos seguintes são operados sob uma capa de cultura de células. Remover o sobrenadante, re-suspender o sedimento em 25 ml desolução a 6 e permitir a sedimentação das células durante 10 min.
   5. Contar as células e remover o sobrenadante, adicionar 25-50 ml de solução 6 sobre as células.

5. Preparação de cardiomiócitos para celular Eletrofisiologia, Bioquímica ou se os estudos

1. Para os estudos de electrofisiologia, manter os miócitos em solução a 6 num tubo de 50 ml e inibir a sedimentação.
2. Para estudos bioquímicos, de imagem de cálcio, por exemplo, miócitos placa sobre placas de cultura de células revestidas de laminina (concentração final de 20 ug / ml de laminina em PBS).
3. Para coloração por imunofluorescência preparar um prato de cultura de células da placa com lamelas de vidro e revestida com laminina solução (concentração final de 50 ng / ml de laminina em PBS).
   1. Remover a solução de revestimento antes de miócitos. Placa das células e controlar a densidade de células, usando um microscópio.
   2. Deixe os miócitos aderir a tampa deslizante, durante 1 hora a 37 ° C em 2% de CO _2, remover a solução dee começar imediatamente com um protocolo padrão de coloração procedimento.
   3. Incubar com fixador, por exemplo, PFA 4% em PBS (pH 7,5) durante 10 min à temperatura ambiente e seguir com três passos de lavagem com PBS durante 5 minutos cada.
   4. Para permeabilizar as células e para inibir a ligação do anticorpo não específico incubar os miócitos com soro a 10%, Triton 0,3%, BSA a 0,2% em PBS durante 30 min à temperatura ambiente.
   5. Incubar com o anticorpo primário durante 1 hora a 37 ° C e lava-se, tal como descrito antes.
   6. Incubar com o anticorpo secundário durante 1 h à temperatura ambiente. Para contracoloração os núcleos e α-actinina utilização DAPI e faloidina conjugada fluorocromo (Alexa Fluor 488, Invitrogen).
   7. Após a lavagem, transferir a tampa de vidro desliza cuidadosamente sobre silano lâminas de microscópio tratados e células embed meio de montagem de fluorescência.

6. Eletrofisiologia celular

1. Realize Whole-cell patch-clamp gravações em freshly isolado cardiomiócitos atriais e ventriculares, à temperatura ambiente.
2. Transferir saudáveis ​​cardiomiócitos que aparecem na câmara de perfusão preenchido com um determinado volume de solução de banho extracelular. 117 mM de NaCl, 4 mM de KCl, 1 mM de KH ₂ PO _4, 4 mM _de NaHCO3, 1,7 mM MgCl _2, 3 mM de _CoCl2, 10 mM de HEPES, 10 mM de glucose, e 0,02 mM de tetrodotoxina (TTX), (pH 7,4) . Use NaOH para ajuste a valor de pH.
3. Use equipamento adequado de fixação adesivo (isto é, microscópio invertido IX71, um amplificador Multiclamp 700B, um sistema de aquisição de Digidata 1440A e PC com pClamp10.3 software (Molecular Devices)).
4. Usar pipetas de remendo com resistências de 3-5 MQ quando preenchidos com a solução intracelular contendo 130 mM de KCl, 2 mM _de MgCl2, 11 mM de HEPES, 11 mM de EGTA, 5 mM de Na ₂ ATP, 0,4 mM de Na ₂ GTP, 5 mM de Na ₂ CP e 4,9 mM de CaCl ₂ (pH 7,2). Use KOH para ajuste a valor de pH.
5. Evoke exterior K + correntes dupassos do anel 4,5-sec tensão para testar potenciais entre -60 e +50 mV em incrementos de 10 mV a partir de um potencial de manutenção de -70 mV, depois de um 20-mseg prepulse mV para -40.
6. Certifique-se de correntes de fuga são sempre <100 pA.
7. Para dissecção de K + diferente correntes utilizar inibidores específicos, tais como a 4-aminopiridina (4-AP; ICN Biomedicals, Irvine, CA, EUA), Heteropodatoxin 2 (HpTx2; Alomone) ou de tetraetilamónio (TEA, Sigma). As soluções-mãe devem ser preparados em uma solução de banho extracelular, e aplicado directamente na vizinhança mais próxima possível da célula através de um microtip depois "de base" de gravações. Equilíbrio deve ser permitida por 2-3 minutos antes de "drogas" gravações.
8. Para a análise de normalizar as amplitudes de corrente nas células individuais de tamanho de célula (células inteiras capacitância de membrana). Analisar dados offline usando pClamp10.3 software (Molecular Devices) ou software comparável.

Resultados

Isolamento de cardiomiócitos murinos adultos de camundongos geneticamente modificados para estudar a função de genes específicos de interesse in vitro tornou-se uma ferramenta poderosa para entender a fisiopatologia cardíaca. Este método é usado atualmente por apenas um número pequeno mas crescente de laboratórios de ciências básicas em todo o mundo. No entanto, o isolamento dos cardiomiócitos do ventrículo adultos murinos pode ser complicado e precisa ser feito cuidadosamente e repetidamente por mãos experient...

Discussão

Com o desenvolvimento crescente de estirpes de ratos geneticamente modificados para estudar a função cardíaca e patologia cardíaca relacionada com deleção do gene também existe um crescente interesse em métodos especializados para estudar os efeitos da supressão do gene específico in vitro. Em nosso laboratório estudamos os papéis de uma família de subunidades Kv canais auxiliares na repolarização cardíaca. Os genes KCNE compreendem uma família de cinco genes (KCNE1-5) que desempenham papéis i...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia
Tetrodotoxina	Alomone
4-aminopiridina	ICN Biomedicals
Heteropodatoxin 2	Alomone
Tetraethylammonium	Sigma Chemicals
Colagenase do Tipo 2	Worthington