Descrevemos aqui um método eficaz para o estudo da dinâmica de depuração de células apoptóticas In vivo. Este método emprega viver Drosophila Embriões como um poderoso modelo de monitorização da fagocitose de células apoptóticas através de marcação específica de células apoptóticas e fagócitos.
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Artigo de método
Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante
Neste artigo
Resumo
Resumo
A eliminação adequada de células indesejáveis ou aberrante através de apoptose e fagocitose subseqüente (clearance celular por apoptose) é crucial para o desenvolvimento normal em todos os organismos metazoários. Recarga celular por apoptose é um processo altamente dinâmico intimamente relacionado com a morte das células, as células apoptóticas unengulfed são mal vistas in vivo sob condições normais. A fim de compreender as diferentes etapas de depuração de células apoptóticas e comparar os fagócitos "profissionais" - macrófagos e células dendríticas em 'não profissional' - células vizinhas tecido residente, in vivo de imagens em directo do processo é extremamente valiosa. Aqui nós descrevemos um protocolo para estudar a liberação celular por apoptose em embriões de Drosophila ao vivo. Para acompanhar a dinâmica das diferentes etapas da fagocitose usamos marcadores específicos para células em apoptose e fagócitos. Além disso, podemos monitorar dois sistemas em paralelo fagócitos: macrófagos 'profissionais' e 'semi-profeglia ssional 'no sistema nervoso central em desenvolvimento (SNC). O método aqui descrito emprega o embrião de Drosophila como um modelo excelente para estudos de depuração de células apoptóticas em tempo real.
Introdução
A eliminação adequada de células indesejadas ou aberrante através de apoptose e fagocitose subsequente é crucial para o desenvolvimento embrionário, bem como para a homeostase dos tecidos no adulto. A fagocitose de células apoptóticas ou na depuração de células apoptóticas é um processo altamente dinâmico, que prossegue em quatro passos: (1) o recrutamento de fagócitos para a célula apoptótica ('encontrar-me'), (2) reconhecimento da célula como um alvo para a fagocitose ( 'comer-me') e (3) imersão, seguido de (4) e da maturação do fagossoma e degradação da partícula apoptótica 1-5. Existem dois tipos de f....
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Protocolo
Para seguir as dinâmicas de depuração de células apoptóticas in vivo duas populações de células deve ser rotulada: células fagocitárias e células apoptóticas.
Para marcar populações de células fagocíticas usamos uma linha de Drosophila que contém o marcador simular cytGFP, que rotula as células fagocíticas exclusivamente no embrião: macrófagos, células gliais e ectoderma 8. Pode-se usar diferentes marcadores de células fagocíticas, incluindo linhas contendo um driver Gal4 específico hemocyte (CRQ-Gal4) ou glia específico Gal4 condutor (repo-Gal4) e um repórter fluorescente geneticame....
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Resultados
Representativos de fotogramas de um filme em que as células apoptóticas são rotulados com anexina V, e as células gliais, ectoderme e macrófagos são rotulados com simular cytGFP são mostrados na Figura 2. Cada quadro é uma projeção de três fatias de 2 m cada.
O embrião de fase 15 está adequadamente posicionada mostrando o SNC embrionárias em meio com células gliais bem marcado (g). Macrófagos (m), que são na sua maioria fora do SNC, mostram forte expressão GFP citop.......
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Discussão
Desembaraço celular por apoptose é um último estágio crítico de apoptose, que é altamente dinâmico. Portanto, estudos sobre o processo em tempo real são de extrema importância. Aqui nós descrevemos um protocolo que permite o monitoramento de folga celular por apoptose no desenvolvimento de embriões de Drosophila vivendo. Neste processo, duas populações de células deve ser marcado com marcadores específicos: células apoptóticas e fagócitos. O repórter simular cytGFP é adequado para monitorizar fagocític.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma Marie Curie Reintegração Grant (IRG249084). Agradecemos a todos os membros do laboratório Kurant.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagente | |||
| Anexina V | Sondas Moleculares | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| Sondas Moleculares | LysoTracker | L-7528 | |
| Óleo de halocarbono 700 | Sigma | H8898 | |
| < strong>Material | |||
| Tubo capilar | FHC | 30-30-0 | |
| Filtro de células | SPL | 93100 | |
| Pincel |
Referências
- Kinchen, J. M. A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 78....
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Reimpressões e permissões
