Medição da alodinia táctil em um modelo murino de prostatite bacteriana

Resumo

Infecção da próstata pode ser um fator que contribui na mediação dor pélvica na prostatite crônica. Descreve-se o processo para a preparação do inoculo bacteriano padronizado, a instilação de bactérias para dentro da uretra de ratos machos e metodologia para medir a alodinia táctil em ratos ao longo do tempo.

Resumo

Escherichia coli uropatogênica (UPEC) são patógenos que desempenham um papel importante em infecções do trato urinário e prostatite bacteriana ^1. Temos mostrado recentemente que UPEC têm um papel importante na iniciação da dor pélvica crônica ^2, uma característica de prostatite crônica / síndrome de dor pélvica crônica (CP / CPPS) ^3,4. Infecção da próstata por UPEC clinicamente relevante pode iniciar e estabelecer a dor crónica, através de mecanismos que podem envolver danos nos tecidos e a abertura dos mecanismos de auto-imunidade ^5.

Um desafio para a compreensão da patogénese de UPEC na próstata é a relativa inacessibilidade da glândula da próstata a manipulação. Utilizamos um método previamente descrito infecção intra-uretral ⁶ para proporcionar uma estirpe clínica de UPEC em ratinhos macho estabelecendo assim uma infecção ascendente da próstata. Aqui, descrevemos nossos protocolos para padronizar a bacterial inoculo ^7, bem como o procedimento para a cateterização anestesiados ratos machos por instilação de bactéria.

CP / CPPS é essencialmente caracterizada pela presença de alodinia táctil ^4. Testes de comportamento foi baseada no conceito de hiperalgesia cutânea resultante referidas ^8-10 dores viscerais. Um foco irritável em tecidos viscerais reduz o limiar da dor cutâneas permitindo uma resposta exagerada a normalmente não estímulos dolorosos (alodinia). Aplicação de uma força normal para a pele, em resultado respostas anormais que tendem a aumentar com a intensidade da dor visceral subjacente. Descrevemos metodologia em NOD / ShiLtJ ratos que utilizam fibras de von Frey para quantificar alodinia táctil ao longo do tempo em resposta a uma única infecção com bactérias UPEC.

Protocolo

1. Bactérias Preparação para inoculação em camundongos

A seguir, deve ser feita sob condições assépticas.

1. Tome um 17 x 100 milímetros tubos de polipropileno com tampas e adicionar 3 ml de caldo de Luria frescas (LB) de mídia. Utilizando pontas autoclavadas, levará algum estoque de glicerol congelado da estirpe de bactérias CP1 ² e transferir uma pequena quantidade da cultura para o tubo contendo os meios LB. Substituir a tampa do tubo de modo a que o oxigénio é ainda capaz de entrar no tubo - a cultura tem de crescer em condições aeróbias. Colocar o tubo de a 37 ° C numa incubadora com agitação a 220 rpm durante a noite.
2. No dia seguinte, transferir 5 ul da cultura durante a noite para um novo tubo com 3 ml de meio LB e crescer sob condições estáticas durante a noite, numa incubadora a 37 ° C.
3. No dia 3, a transferência de 40 | il da cultura em aa tubo de 50 ml contendo 40 ml de meio LB a cada. Coloque em uma noite 37 ° C incubadora estática.
4. Ligar e configurar centrífuga a 4 ° C.Uma vez que tenha atingido a temperatura de centrifugação final, transferir cada cultura de 40 ml para um tubo de centrífuga de 40 ml Nalgene.
5. Pesar tubos para equilibrar centrífuga - ajustar o volume com a mídia LB, conforme necessário. Girar os tubos a 6000 rpm durante 20 min.
6. Cuidadosamente remover o sobrenadante e suspender suavemente pellet bacteriano em 40 ml de PBS estéril.
7. Repetir o passo 1.5 com PBS.
8. Aspirar o sobrenadante e suspender as bactérias em 500 ul de PBS estéril. Transferir a solução para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Tomar 10 ul de suspensão e dilui-se em 990 ul de PBS gelado. Utilizar um espectrofotómetro para ler a densidade óptica _{420 nm} para determinar o volume necessário para a inoculação. Para determinar o volume apropriado de PBS gelado a suspender o granulado em: Tome o número OD _{420 nm} (em ml), e subtrair o volume estimado do pellet bacteriano [ex. OD _{420 nm} = 0,545, pellet ml aproximadamente 0,075. ,545-0,075 = 0,470].
9. Remover 10 ul de suspensão bacteriana e dialaúde em 990 ul PBS gelado. Leia as _nm OD _420. A meta é alcançar um valor de OD _{420 nm} da suspensão diluída de 1,000 ± 0,010. Se o número de sua diluição é acima deste alvo, adicionar mais volume para a suspensão e ter outra leitura. Se o número estiver abaixo do 0,990 então girar a suspensão e repita OD leitura _{nm 420} até a obtenção de leitura desejada.

2. A infecção de animais

Os ratinhos (5-7 semanas de idade, dez por grupo) foram adquiridos a Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

1. Os ratos são anestesiados por inalação de 1-4% de isoflurano numa câmara de plexiglas e são monitorizados até reclinada.
2. Um rato de cada vez é levado para a instilação de bactérias por cateterização com um polietileno (PE10), ligado a um cateter de agulha G 30 modificado de uma seringa Hamilton de vidro (comprimento de 1,5-2,0 cm). O cateter é inserido para o cubo da agulha. O mouse é placed na sua superfície dorsal sob anestesia mantida através de um cone de nariz.
3. O pênis do mouse é expulso pela pressão suave e quantidades liberais de lubrificante em cotonetes é usado para a lubrificação de entrada da uretra peniana.
4. 10 ul de solução salina tamponada com fosfato contendo 1 x 10 ⁸ bactérias é introduzido na uretra de ratos anestesiados após cateterização.
5. Os ratos são mantidos em um estado anestesiado durante 15 minutos na câmara de Plexiglas após introdução bacteriana para permitir a fixação de bactérias e para evitar a micção imediata.
6. Os ratos são colocados de volta em suas gaiolas e monitorados para o próximo 24 hr.

3. Teste de comportamento

Os ratinhos foram testados antes da infecção (linha de base) e nos dias 3, 7, 14, 21 e 28 após a infecção. Hiperalgesia referido e alodinia táctil foi testada utilizando filamentos de von Frey aplicado ao abdómen ^11,12 eo r plantarEgion da pata traseira ^13. Testes, foi realizado em um tempo fixo de dia, metodologia padrão e teste experimentador única de todos os animais foram empregados. Testes cegado dos grupos foi utilizado para combater as limitações de comportamento baseados em testes da dor em modelos animais. Cinco individuais de filamentos de von Frey, com forças de 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 e 4,0 g (Stoelting, EUA) foram aplicados no abdómen e frequência das respostas de retirada foi calculada.

1. Depois de um período de 30 minutos de aclimatação, os ratos são colocados em câmaras de Plexiglas individuais (6 x 10 x 12 cm) feitos em casa com um chão de grelha de aço inoxidável de arame.
2. Hiperalgesia referido e alodinia táctil foram testados utilizando os cinco filamentos de von Frey. Cada filamento foi aplicado durante 1-2 segundos, com um intervalo inter-estímulos de 5 segundos para um total de 10 vezes, e os cabelos foram testados em ordem crescente de força.
3. Cada filamento é aplicada à área abdominal inferior, na vizinhança geral da próstata ecuidado foi tomado para estimular diferentes áreas dentro desta região para evitar dessensibilização ou "acabar" efeitos. Os filamentos foram aplicados em ordem crescente de força durante 1-2 segundos com intervalos de pelo menos 5 segundos entre as estimulações para um total de 10 vezes.
4. Três tipos de comportamento são considerados uma resposta positiva à estimulação filamento: 1) retração acentuada do abdômen; 2) lamber imediata ou coçar a área de estimulação filamento; salto 3).
5. Frequência de resposta foi calculada como a percentagem de resposta positiva (de 10, por exemplo, 5 respostas de 10 = 50%) e os dados foram relatados como a percentagem média de resposta de frequência ± SE
6. Os animais com mais de 25 positivos respostas basais totais são excluídos do estudo.
7. Tactile allodynia foi testado na região plantar da pata traseira utilizando filamentos de von Frey, com forças de 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 e 4,0 g. O limiar de retirada mediana de 50% (5), foi avaliada por meio do up-downmétodo em que o teste foi iniciado com 0,04 g de filamentos aplicado perpendicularmente à superfície plantar da pata posterior até o filamento dobrados ligeiramente. Os filamentos foram testados em ordem crescente até que uma resposta positiva foi observada. Uma resposta positiva para o filamento foi definida quer como uma suspensão acentuada da pata ou lamber a pata de teste. Quando uma resposta positiva foi registado o seguinte filamento mais fraco foi aplicada, e se a resposta negativa foi observada, em seguida, o filamento foi aplicado ao lado mais forte.
8. Os experimentos e metodologia descritos foram analisados ​​e aprovados pelo cuidado com os animais Northwestern University e usar comitê.

Resultados

Examinámos NOD / ShiLtj e C57BL/6J ratinhos macho para a presença de dor crónica após infecção bacteriana. Ratos machos (5-7 semanas de idade) foram instilados com solução salina ou de bactérias no interior da uretra (Figura 1). Estimulação mecânica da área pélvica com filamentos de von Frey de camundongos C57BL/6J instilados com solução salina e ratinhos C57BL/6J UPEC infectados resultou numa resposta de frequência que não se alterou durante o curso de 28 dias da experiência (Figura 1).

Discussão

Infecção da próstata do rato com UPEC permite a modelagem em vivo de eventos que podem estar envolvidos na patogénese da prostatite bacteriana, CP / CPPS ou como um evento de predisposição em inflamação crónica. Os métodos descritos para a preparação bacteriana e empate instilação em cima de um grande corpo de literatura sobre modelos UPEC em infecção do trato urinário feminino ^7,14. O modelo tem grande aplicabilidade para o estudo da patogênese, testando vacinas candidatas potenciais e mecanismos de...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Os tubos de cultura	BD Falcon	352059
LB Miller	EMD	EM1.10285.0500
Tubos de centrífuga Nalgene	Thermo	3118-0050
Isoflurano	Butler Schein	NDC 11695-6776-1
30G agulha cateter	Hamilton	91030
PE10 tubulação	BD intramedic	427400
Os filamentos de von Frey	Stoelting	58025-31