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Artigo de método

O Uso de quimiostatos em Microbial Biologia de Sistemas

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⸱

DOI:

10.3791/50168

⸱

14 de outubro de 2013

 ,  , 
1Center for Genomics and Systems Biology, Department of Biology, New York University

Neste artigo

Resumo

Taxa de crescimento celular é um processo regulado e um dos principais determinantes da fisiologia celular. Cultura contínua usando quimiostatos permite o controle extrínseco da taxa de crescimento celular por limitação de nutrientes facilitar o estudo de redes moleculares que controlam o crescimento celular e como essas redes de evoluir para otimizar o crescimento celular.

Resumo

Células regular sua taxa de crescimento em resposta a sinais do mundo externo. À medida que a célula cresça, diversos processos celulares deve ser coordenado, incluindo a síntese de macromoléculas, o metabolismo e, em última instância, o compromisso com o ciclo de divisão celular. O quimiostato, um método de controlar a taxa de crescimento experimental de células, proporciona um meio poderoso de estudar sistematicamente como os impactos a taxa de crescimento de processos celulares, incluindo a expressão de genes - e metabolismo - e as redes reguladoras que controlam a taxa de crescimento celular. Quando mantido por centenas de gerações quimióstatos podem ser usadas para estudar a evolução adaptativa de micróbios em condições ambientais que limitam o crescimento das células. Descreve-se o princípio de cultivos contínuos, demonstrar seu funcionamento e dar exemplos de suas diversas aplicações. Após um período de desuso após a sua introdução em meados do século XX, a convergência das metodologias genoma escala com uma renovada emteresse na regulação do crescimento celular e as bases moleculares da evolução adaptativa está estimulando um renascimento no uso de quimiostatos na pesquisa biológica.

Introdução

O crescimento das células é regulada por redes complexas de interagir factores genéticos e ambientais 1,2. O regulamento multifatorial do crescimento celular exige uma abordagem em nível de sistema para seu estudo. No entanto, o estudo rigoroso do crescimento celular regulamentada é desafiado pela dificuldade de controlar experimentalmente a velocidade com que as células crescem. Além disso, até mesmo nas experiências mais simples condições extracelulares são freqüentemente dinâmico e complexo como as células alteram continuamente o seu ambiente à medida que proliferam. Uma solução para estes problemas é fornecido pelo quimiostato: um método de cultura de células que permite o controlo das taxas de crescimento experimental de células em ambientes definidos, invariante e controladas.

O método de cultura contínua usando um quimiostato foi descrito de forma independente por Monod 3 e Novick & Szilard 4 em 1950. Como originalmente concebida, as células são cultivadas em um volume fixo de mídia que é connuamente diluída pela adição de novas mídias e remoção simultânea de mídias antigas e células (Figura 1). Acoplado equações diferenciais ordinárias (Figura 2) descrevem a taxa de variação da densidade de células (x) e a concentração de um nutriente limitante do crescimento (s) no recipiente de quimiostato. Importante, este sistema de equações prevê uma única (não-zero) estável no estado estacionário (Figura 3), com a implicação notável que, no estado estacionário, a taxa de crescimento específico das células (ou seja, a constante da taxa de crescimento exponencial) é igual à taxa em que a cultura é diluída (D). Através da variação da taxa de diluição é possível estabelecer populações de estado estacionário de células em diferentes taxas de crescimento e sob diferentes condições de limitação de nutrientes.

O controle experimental da taxa de crescimento usando quimiostatos foi fundamental para o desenvolvimento de uma compreensão de como as mudanças fisiologia celularcom taxas de crescimento de 5,6. No entanto, este antigo pilar de métodos microbiológicos tornou-se cada vez mais obscuro durante a explosão na investigação em biologia molecular, durante o final do século XX. Hoje, renovou o interesse no controlo do crescimento de ambos os micróbios e organismos multicelulares e o advento de métodos genoma escala para análise de sistemas de nível renovou motivação para a utilização de quimióstatos. Aqui, descrevemos três aplicações que capitalizar sobre o controle preciso das taxas de crescimento das células e para o ambiente externo que são exclusivamente possível usando quimiostatos. Em primeiro lugar, descreve-se o uso de quimióstatos para investigar a forma como a abundância de milhares de biomoléculas - como transcritos e metabolitos - são coordenadamente regulada com a taxa de crescimento. Em segundo lugar, nós descrevemos como quimiostatos pode ser usada para obter estimativas precisas das diferenças de taxas de crescimento entre os diferentes genótipos em ambientes com limitação de nutrientes, utilizando experimentos de competição. Em terceiro lugar, nós descrevemos como quimiostatos podeser usado para estudar evolução adaptativa de células que crescem em ambientes pobres em nutrientes constantes. Estes exemplos exemplificar as formas em que quimiostatos estão permitindo investigações em sistemas de nível de regulação do crescimento celular, gênica por interações ambientais e evolução adaptativa.

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Protocolo

O princípio da cultura contínua usando um quimiostato pode ser realizado em uma variedade de implementações. Em todos os quimióstatos é essencial ter um) métodos para manter a esterilidade de todos os componentes, 2) uma cultura bem misturada, 3) arejamento adequado do vaso de cultura e 4) um meio confiável de adição e remoção de meios de cultura. Aqui, descrevemos a utilização de um bioreactor de Sixfors (Infors Inc) como um quimiostato utilizando métodos que podem ser prontamente adaptados para configurações alternativas.

1. Montagem das embarcações chemostat

  1. Ligue os Sixfors usando o interruptor principal.
  2. Lave bem o recipiente chemostat, montagem agitador, e tubos ligados com deionizada (DI) de água. Confira toda a tubulação e o-rings e substituir quaisquer peças desgastadas procurando.
  3. Certifique-se a base de apoio veio de accionamento está virada para cima no recipiente de vidro e que a parte superior do veio de accionamento é encaixado no seu alojamento no conjunto agitador. Defina o stirremontagem r-se no reactor de vidro assegurando a parte inferior do veio de accionamento está encaixado no suporte de eixo rígido. Use o grampo para fixar o conjunto do agitador para o recipiente de vidro.
  4. Encher o vaso com cerca de 300 ml de água DI.
  5. Retire as tampas de um oxigênio dissolvido (OD 2) sonda e verificar o nível do eletrólito, desapertando a carcaça inferior e certificando-se de que a caixa do fundo está cheio até a metade com solução eletrolítica. Rescrew o revestimento inferior e inserir na porta do navio chemostat. Aperte até dedo apertado.
  6. Dê uma sonda de pH e removê-lo de seu buffer de armazenamento (3 M KCl). Retire a tampa da sonda de pH e anexar ao fermentador 1. Usando a tela de controle Sixfors, navegue até o menu de parâmetros de fermentação e selecione "calibrar pH". Coloque a sonda de pH em um buffer padrão pH 7 e registre a leitura como alta Read. Repita com tampão pH 4 e registre a leitura como Low Read. Retire a sonda de pH do fermentador, lavar com água DI e introduzir a sonda into porto no navio chemostat. Aperte até dedo apertado.
  7. Colocar o recipiente chemostat no rack. Nota sobre a embarcação que fermentador (1-6) a sonda de pH foi conectada e calibrado. Coloque a tampa da sonda de pH na sonda de pH. Usando folha de cobrir bem a parte superior da sonda DO 2.
  8. Dobrar a folha ao longo das extremidades do tubo ligado ao recipiente de quimiostato.
  9. Repita os passos de 1,2-1,8 para todas as embarcações.
  10. Esterilizar por autoclavagem dos vasos lhes durante 15 minutos num ciclo de líquidos.

2. Preparação da mídia

  1. Estabelecer a faixa-limite de concentração de um nutriente por uma crescente cultura de lotes em diferentes concentrações de nutrientes. O nutriente é limitante na gama em que a densidade celular final é uma função linear da concentração de nutrientes inicial (Figura 4). Selecione uma concentração de nutrientes bem dentro da faixa de limitação. Exemplos de composição de mídia padrão para estudos com Saccharomyces cerevisiae estão disponíveis em 7-11.
  2. Autoclave um garrafão vazio que é tapado com uma rolha de borracha que contém uma entrada de ar e meios de saída após a primeira assegurando que a extremidade do tubo de media está coberta em folha.
  3. Em um recipiente separado preparar 10 L de meios de comunicação.
  4. Coloque uma xícara de 500 ml de filtro para um frasco de 100 ml de mídia. Retire o filtro de algodão com uma pinça esterilizados em etanol e anexar imediatamente à porta filtração no garrafão mídia.
  5. Prenda o garrafão de mídia a uma fonte de vácuo e filtro de esterilizar mídia, adicionando-o ao copo do filtro.
  6. Quando filtração dos meios de comunicação é completa, fechar a porta de filtração com uma braçadeira de metal.

3. Calibrar fazer 2 Sondas e Configurando chemostat

  1. Depois de os vasos em quimiostato foram autoclavados e deixou-se arrefecer o lugar do navio no seu revestimento de calor correspondente. Ligue o sensor de temperatura, sonda de pH, e fazer 2 sonda. Deixe onavio sentar-se com o poder por pelo menos 6 horas para permitir que os fazer 2 sondas de polarizar.
  2. Coloque a extremidade de cada tubo de efluentes em um receptáculo de coleta separado. Conecte o suprimento de ar através de um filtro autoclavado e ativar o fluxo de ar. A água em cada navio deverá sair dos tubos de efluentes, o que indica que todos os selos são devidamente formado.
  3. Ajustar a altura do tubo efluente de acordo com o volume de trabalho desejado (por exemplo, 300 ml). Usamos uma régua que está marcado com a colocação de tubos calibrados para diferentes volumes de trabalho.
  4. Conecte o garrafão de mídia para o navio chemostat. Use etanol, a fim de manter o tubo termina como estéril quanto possível. Passe a tubulação da bomba através da bomba e pinça aberta. Pressionar manualmente a bomba até que a mídia começa a fluir para dentro do vaso chemostat. Solte a tubulação da bomba, a mídia deve fluir livremente para dentro do vaso chemostat. Quando a mídia atinge o tubo de efluentes, recoloque a tubulação à bomba e pinça.
  5. Comece running o programa básico com impulsor conjunto a 400 rpm e a temperatura fixada em 30 ° C.
  6. Para calibrar fazer 2 sondas, desligue o suprimento de ar e mudar para o gás nitrogênio. Espere pelo menos uma hora e registro de valor medida como "baixo de leitura". Volte para o fornecimento de ar (ou seja, contendo concentração de oxigênio ambiente), espere pelo menos uma hora e medição registro como "alta de leitura".
  7. Iniciar a gravação de dados usando o software Iris.

4. Inoculação

  1. Usar 70% de etanol para esterilizar a parte superior do vaso de cultura.
  2. Remover o parafuso na parte superior do vaso e pipeta de 1 ml de uma cultura durante a noite para dentro do vaso quimiostato. Volte a apertar o parafuso.
  3. Indique o tempo de inoculação em Iris.
  4. Espere cerca de 24 horas para que as culturas para atingir fase estacionária adiantada. À medida que a cultura cresce, oxigênio dissolvido e pH diminuirá. No caso dos meios de limitação de glucose, oxigénio dissolvido voltará a ~ 100% em pha estacionáriasi. Por outras limitações nutricionais oxigénio dissolvido permanecerá <100% na fase estacionária.

5. Iniciando Bombas e Atingir estado estacionário

  1. A taxa de diluição é calculada dividindo o caudal (quanto mídia flui para dentro do vaso por hora) através do volume de cultura. Por exemplo, usando um volume de 300 ml, uma taxa de diluição de 0,1 significa que 30 ml de meio é adicionada à cultura a cada hora. Uma vez que o sistema se encontra sob pressão positiva o mesmo volume é removido a partir do vaso de assegurar que a cultura é continuamente diluído. Uma gama de taxas de diluição (D) pode ser usado, que não excedam a taxa máxima de crescimento (μ max) das células, acima do qual as células serão lavadas para fora do chemostat.
  2. Escolha as configurações de bomba, que especificam o número de segundos a bomba é ligado e desligado, para estabelecer a vazão desejada. A bomba fornece meios de comunicação, a uma taxa de ~ 0,11 ml / seg.
  3. Definir um programa usando o Sixfors interface que especifica o tempo da bomba, a temperatura ea velocidade do rotor. Inicie o programa.
  4. Esvazie os recipientes de coleta de líquido e registrar o tempo.
  5. Depois de pelo menos duas horas, utilizar uma proveta para medir a quantidade de meios de comunicação tenha sido removido a partir do vaso. Isto será igual ao volume que foi adicionado ao recipiente de quimiostato. Calcular a taxa de diluição (D = V efluentes / V Cultura / tempo). Ajuste as configurações da bomba se a taxa de diluição calculada não coincide com taxa de diluição desejada.
  6. No estado estacionário, a densidade celular no quimiostato não muda ao longo do tempo. Isto pode ser medido sem perturbar a cultura através da amostragem do fluxo de saída. Nós operacionalmente definir atingir o estado estacionário como medições da densidade de células idênticas que são separadas por pelo menos uma duplicação da população. Alcançando estado estacionário levará aproximadamente oito gerações de cultura após o início da diluição da cultura. No estado de equilíbrio, as células crescem exponencialmente (i.e. taxa de crescimento constante ao longo do tempo), em condições limitadas em nutrientes. O tempo de duplicação da população (tempo de geração) é ln (2) / D.
  7. Continuar a medir periodicamente efluentes para a duração da experiência para assegurar que uma taxa de diluição é mantida constante.

6. Aplicação 1: estudar as células a crescer a taxas diferentes em condições de estado estacionário

  1. No estado estacionário no quimiostato, a taxa de crescimento da população de células é igual à taxa de diluição. Ao alterar sistematicamente a taxa de diluição é possível cultivar células em taxas diferentes. Isso permite que o estudo sistemático de parâmetros fisiológicos que variam de acordo com a taxa de crescimento, incluindo o volume da célula, o estágio do ciclo celular e resistência ao estresse. Além disso, os perfis de estado estacionário de ARNm globais, proteína e níveis de metabolito pode ser ensaiada em células em crescimento em taxas diferentes. Há duas maneiras de adquirir amostras:
  2. Pequenas amostras podem ser passivamente obretidos pela colocação da extremidade do tubo efluente em um tubo de 1,5 ml ou 15 ml. Uma amostra de 1-5 ml pode ser obtido em poucos minutos (dependendo da velocidade de fluxo). Muitos parâmetros fisiológicos pode ser medido a partir dessas amostras.
  3. Expressão de genes, ou de metabolito análises exigem maiores amostras que devem ser obtidos mais rapidamente possível. Coloque a extremidade do tubo efluente em um tubo cónico de 15 ml. Solte o parafuso que prende a ponta de metal do tubo de efluentes e empurrar para baixo suavemente. A ~ 10 ml de amostra vai rapidamente preencher o seu tubo. Tenha em atenção que o volume no vaso de quimiostato mudou. Se várias amostras consecutivas são tomadas pode ser necessário para reduzir o fluxo para manter uma taxa de diluição constante.

7. Aplicação 2: Medição precisa das diferenças de taxas de crescimento entre os genótipos em ambientes controlados usando ensaios de competição baseados em citometria de fluxo

  1. Quimióstatos pode ser utilizado para quantificar com precisão o efeito da concentração de nutrientessobre as diferenças nas taxas de crescimento (ou seja, de aptidão) entre diferentes origens genéticas. Por estirpes de co-cultura marcados com diferentes proteínas fluorescentes a taxa de alteração na abundância relativa durante o crescimento exponencial é determinada. A realização deste ensaio, em diferentes taxas de diluição (D) permite o estudo dos efeitos de concentração de nutrientes (s) sobre as diferenças de aptidão.
  2. Estabelecer culturas de estado estacionário das duas linhagens nos vasos quimiostato separadas com taxas de diluição idênticos e um volume de 300 ml.
  3. Passivamente amostra 1 ml de cada navio. Gire as células, ressuspender em tampão fosfato (PBS) e colocar a 4 ° C. Estas amostras contêm amostras de células homogêneas, que são controles para a análise de citometria de fluxo subseqüente.
  4. Coloque o tubo de efluentes de um navio em um cilindro graduado autoclavado. Solte o parafuso que prende a ponta de metal do tubo de efluentes e empurre para baixo para expelir as células do chemostat. Quandoo volume atinge 150 ml, devolver o metal final do tubo efluente para a sua posição original (300 ml). Repetir com o segundo vaso, utilizando uma proveta graduada diferente.
  5. Use etanol a 70% para manter a esterilidade durante a remoção do parafuso na parte superior do vaso de quimiostato. Coloque funil na abertura e despejar 150 ml de outra cultura no vaso quimiostato. Volte a apertar o parafuso. Repetir com o segundo vaso, usando o segundo funil. Cada vaso quimiostato agora contém uma mistura das duas estirpes.
  6. Obter uma amostra de 1 ml de cada navio utilizando amostragem passiva cada 2-6 horas. Gire as células, ressuspender em PBS e armazenar a 4 ° C. Continue a tomar amostras para a gravação de 2-3 dias com cuidado o tempo que cada amostra foi colhida.
  7. No fim do experimento, sonicado e diluir as amostras a ~ 2 x 10 6 células / ml. Utilizando citometria de fluxo, medir a proporção das duas estirpes em cada amostra. Como ambas as tensões estão crescendo exponencialmente, a diferença da taxa de crescimento relativo édeterminada por regressão linear de ln (strain1/strain2) contra o tempo (medido em gerações). O declive da regressão é proporcional à diferença na taxa de crescimento (isto é, a vantagem de fitness) de uma estirpe em relação à outra.
  8. Como a cultura mista pode levar algum tempo para atingir um novo estado de equilíbrio, momentos precoce pode caber mal à regressão. Esta questão é melhor resolvido, permitindo 2-3 gerações a decorrer antes de iniciar a amostragem ou removendo pontos iniciais, que são valores atípicos claras. Por outro lado, uma vez que uma cepa tem suplantado o outro os dados não são mais úteis e esses pontos devem ser excluídos.

8. Aplicação 3: Evolução Experimental

  1. Evolução Experimental realizado em quimiostatos seleciona para mutantes que são aumentados em fitness no ambiente limitado em nutrientes. Seleção geralmente é realizada ao longo de centenas de gerações.
  2. Estabelecer uma cultura chemostat estado estacionário utilizando uma cepagenótipo do conhecido (e seqüência do genoma de preferência conhecida) e um nutriente-limitação definida.
  3. Para manter um "registro fóssil" da população adaptação passiva provar chemostat cada 2-3 dias e armazenar a amostra em 15% de glicerol a -80 ° C.
  4. Monitorar o reservatório mídia e reabastecer com meios frescos, se necessário.
  5. Manter a cultura exponencialmente crescente de várias centenas de gerações.
  6. Após a conclusão da placa de selecção de uma amostra de células em placas de agar sólido. Após as células se transformaram em colônias, pegar uma amostra imparcial de colônias usando palitos de dente e inocular clones em poços individuais de uma placa de 96 poços contendo 100 ml de mídia. Permitir amostras clonais para crescer durante a noite, adicionar 100 ml de 30% de glicerol e armazenar em -80 ° C.
  7. Caracterizar clones por seqüenciamento do genoma inteiro e realizando ensaios fenotípicos, incluindo a avaliação de aptidão física, utilizando uma estirpe de referência comum fluorescente etiquetado, conforme descrito na Aplicação 2.

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Resultados

Uma grande vantagem do quimióstatos é a capacidade de controlar a taxa de crescimento das células experimentalmente ao variar a taxa de diluição. Na brotação levedura, Saccharomyces cerevisiae, a morfologia de uma célula é informativo da fase do ciclo de divisão celular. As populações com taxas de crescimento superiores contêm uma maior proporção de células em divisão activa tal como determinado através da medição da fracção de células não gemuladas (Figura 5A). Análises de expressão do mRNA global em c...

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Discussão

Quimióstatos permitir o cultivo dos microrganismos em condições de estado estacionário de crescimento controlado. As células crescem continuamente a uma velocidade constante, resultando em um ambiente externo invariante. Isto está em contraste com os métodos de cultura em lotes em que o ambiente externo está em constante mudança e a taxa de crescimento das células é determinado pela interacção complexa de ambiente e genótipo. Assim, uma importante vantagem da cultura de micróbios em quimióstatos mais culturas de lote é ...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo arranque fundos da Universidade de Nova Iorque. Agradecemos Maitreya Dunham e Matt Brauer, que inicialmente desenvolveu o uso de biorreatores Sixfors como quimiostatos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Infors-HT Sixfors ChemostatRecursos Técnicos Apropriados, Inc. 
Garrafa de Vidro 9.5 LFisher Scientific02-887-1Para Recipiente de Mídia e Mangueira
PinchcockFisher Scientific05-867Para Recipiente de Mídia e Rolha de Mangueira
, Tamanho 12, Neoprene VerdeCole-PalmerEW-62991-42Para Recipiente de Mídia e
Mangueira Conector RetoCole-PalmerEW-30703-02Para Recipiente de Mídia e Mangueira
Geral Laços de propósito 4 inFisher ScientificNC9557052Para Recipiente de Mídia e Tubo de Mangueira
, Borracha de SiliconePeças PequenasB000FMWTDEPara Vaso de Mídia e Tubo de Mangueira
, Silicone, 3/8 in ODFisher Scientific02-587-1QPara Recipiente de Mídia e Tubo de Mangueira
, Silicone, 7/32 in ODFisher Scientific02-587-1EPara Vaso de Mídia e Mangueira
Tubulação, Aço Inoxidável, 3/16 in ODMcMaster-Carr6100K164Para Vaso de Mídia e Tubulação de Mangueira
, Aço Inoxidável, 3/8 in ODMcMaster-Carr6100K161Para Recipiente de Mídia e
Conectores de GanchoFisher Scientific14-66-18QPara Vaso de Mídia e
Braçadeira de CatracaCole-PalmerEW-06403-11Para Vaso de Mídia e Luer de Mangueira
, FêmeaCole-PalmerEW-45512-34Para Vaso de Mídia e Mangueira
Luer, MachoCole-PalmerEW-45513-04Para Vaso de Mídia e Mangueira
Filtro Millipore Aervent MTGR05010 62 mm, 0.2 μ mFisher ScientificMTGR05010Para Vasos de Mídia e Mangueiras
Filtros PTFE Acrodisc CR 13 mm, 0.2 μ mFisher ScientificNC9131037para vaso de mídia e mangueira
Tubo de fluxo de leitura direta para arCole-PalmerEW-32047-77Para configuração de gás nitrogênio
Tubo de fluxo de leitura direta para nitrogênioCole-PalmerEW-32048-63Para configuração de gás nitrogênio
Proporcionador de gás Multitube QuadrosCole-PalmerEW-03218-50Para configuração
de gás nitrogênioRegulador, Airgas analítico de dois estágiosY12-N145D580para configuração de gás nitrogênio
Adaptador de mangueira,AirgasY99-26450configuração de gás nitrogênio
Adaptador machoAirgasWES544para configuração de gás nitrogênio
Norprene TubingUS Plastics57280para instalação de gás nitrogênio
Base de tripéCole-PalmerEW-03218-58Para
Cartuchos de VálvulaCole-PalmerEW-03217-92Para Configuração de Gás Nitrogênio
Carboy 10 LFisher Scientific02-963-2APara Preparação de Mídia
Filtros de Topo de Garrafa de Vácuo Estéril Steritop, 1.000 ml, membrana PES; para tamanho de gargalo de 45 mmFisher ScientificSCGP-T10-REPara Preparação de
Mídia Garrafa de 100 ml, tamanhodo gargalo de 45 mmFisher ScientificFB-800-100Para Preparação de Mídia
cloreto de cálcio· 2H2OFisher ScientificC79-500Reagentes de Mídia
cloreto de sódioFisher ScientificBP358-1Reagentes de Mídia
sulfato de magnésio· 7H2OSigma Aldrich230391Reagentes de
mídia fosfato de potássio monobásicoFisher ScientificAC424205000Media Reagentes
sulfato de amônioFisher ScientificAC423400010Media Reagentes
cloreto de potássioSigma AldrichP9541Reagentes de mídia
ácido bóricoSigma AldrichB6768Reagentes de Mídia
sulfato de cobre· 5H2OSigma Aldrich209198Reagentes de Mídia
iodeto de potássioSigma Aldrich60400Reagentes de Mídia
cloreto férrico· 6H2OReagentes de MídiaFisher ScientificI88-100
sulfato de manganês· H2OSigma Aldrich230391Reagentes de
Mídia molibdato de sódio· 2H2OSigma AldrichM7634Reagentes de Mídia
sulfato de zinco· 7H2OFisher ScientificZ68-500Reagentes de
Mídia biotinaFisher ScientificBP232-1Reagentes de
Mídia pantotenato de cálcioFisher ScientificAC24330-1000Reagentes de Mídia
fólicoSigma AldrichF7876Reagentes de Mídia
inositol (também conhecido como mio-inositol)Fisher ScientificAC12226-1000Reagentes de Mídia
niacina (também conhecido como ácido nicotínico)Sigma AldrichN4126Reagentes de Mídia
ácido p-aminobenzóicoFisher ScientificAC14621-2500Reagentes de Mídia
piridoxina HClSigma AldrichP9755Reagentes de Mídia
riboflavinaSigma AldrichR4500-25GReagentes de Mídia
tiamina HClReagentesMídiaFisher Scientific BP892-100
LeucinaSigma AldrichL8000-100GReagentes de Mídia
UracilSigmaAldrich U0750Reagentes
Mídia DextroseFisher ScientificDF0155-08-5Reagentes de Mídia
de Mangueira de Mangueira de aço inoxidável para mangueira de de Configuração de Gás Nitrogênio ácido de de

Referências

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