Taxa de crescimento celular é um processo regulado e um dos principais determinantes da fisiologia celular. Cultura contínua usando quimiostatos permite o controle extrínseco da taxa de crescimento celular por limitação de nutrientes facilitar o estudo de redes moleculares que controlam o crescimento celular e como essas redes de evoluir para otimizar o crescimento celular.
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Artigo de método
O Uso de quimiostatos em Microbial Biologia de Sistemas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Células regular sua taxa de crescimento em resposta a sinais do mundo externo. À medida que a célula cresça, diversos processos celulares deve ser coordenado, incluindo a síntese de macromoléculas, o metabolismo e, em última instância, o compromisso com o ciclo de divisão celular. O quimiostato, um método de controlar a taxa de crescimento experimental de células, proporciona um meio poderoso de estudar sistematicamente como os impactos a taxa de crescimento de processos celulares, incluindo a expressão de genes - e metabolismo - e as redes reguladoras que controlam a taxa de crescimento celular. Quando mantido por centenas de gerações quimióstatos podem ser usadas para estudar a evolução adaptativa de micróbios em condições ambientais que limitam o crescimento das células. Descreve-se o princípio de cultivos contínuos, demonstrar seu funcionamento e dar exemplos de suas diversas aplicações. Após um período de desuso após a sua introdução em meados do século XX, a convergência das metodologias genoma escala com uma renovada emteresse na regulação do crescimento celular e as bases moleculares da evolução adaptativa está estimulando um renascimento no uso de quimiostatos na pesquisa biológica.
Introdução
O crescimento das células é regulada por redes complexas de interagir factores genéticos e ambientais 1,2. O regulamento multifatorial do crescimento celular exige uma abordagem em nível de sistema para seu estudo. No entanto, o estudo rigoroso do crescimento celular regulamentada é desafiado pela dificuldade de controlar experimentalmente a velocidade com que as células crescem. Além disso, até mesmo nas experiências mais simples condições extracelulares são freqüentemente dinâmico e complexo como as células alteram continuamente o seu ambiente à medida que proliferam. Uma solução para estes problemas é fornecido pelo quimiostato: um método de cultura de ....
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Protocolo
O princípio da cultura contínua usando um quimiostato pode ser realizado em uma variedade de implementações. Em todos os quimióstatos é essencial ter um) métodos para manter a esterilidade de todos os componentes, 2) uma cultura bem misturada, 3) arejamento adequado do vaso de cultura e 4) um meio confiável de adição e remoção de meios de cultura. Aqui, descrevemos a utilização de um bioreactor de Sixfors (Infors Inc) como um quimiostato utilizando métodos que podem ser prontamente adaptados para configurações alternativas.
1. Montagem das embarcações chemostat
- Ligue os Sixfors usando o interruptor principal.
- Lave bem....
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Resultados
Uma grande vantagem do quimióstatos é a capacidade de controlar a taxa de crescimento das células experimentalmente ao variar a taxa de diluição. Na brotação levedura, Saccharomyces cerevisiae, a morfologia de uma célula é informativo da fase do ciclo de divisão celular. As populações com taxas de crescimento superiores contêm uma maior proporção de células em divisão activa tal como determinado através da medição da fracção de células não gemuladas (Figura 5A). Análises de expressão do mRNA global em c.......
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Discussão
Quimióstatos permitir o cultivo dos microrganismos em condições de estado estacionário de crescimento controlado. As células crescem continuamente a uma velocidade constante, resultando em um ambiente externo invariante. Isto está em contraste com os métodos de cultura em lotes em que o ambiente externo está em constante mudança e a taxa de crescimento das células é determinado pela interacção complexa de ambiente e genótipo. Assim, uma importante vantagem da cultura de micróbios em quimióstatos mais culturas de lote é .......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo arranque fundos da Universidade de Nova Iorque. Agradecemos Maitreya Dunham e Matt Brauer, que inicialmente desenvolveu o uso de biorreatores Sixfors como quimiostatos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Infors-HT Sixfors Chemostat | Recursos Técnicos Apropriados, Inc. | ||
| Garrafa de Vidro 9.5 L | Fisher Scientific | 02-887-1 | Para Recipiente de Mídia e Mangueira |
| Pinchcock | Fisher Scientific | 05-867 | Para Recipiente de Mídia e Rolha de Mangueira |
| , Tamanho 12, Neoprene Verde | Cole-Palmer | EW-62991-42 | Para Recipiente de Mídia e |
| Mangueira Conector Reto | Cole-Palmer | EW-30703-02 | Para Recipiente de Mídia e Mangueira |
| Geral Laços de propósito 4 in | Fisher Scientific | NC9557052 | Para Recipiente de Mídia e Tubo de Mangueira |
| , Borracha de Silicone | Peças Pequenas | B000FMWTDE | Para Vaso de Mídia e Tubo de Mangueira |
| , Silicone, 3/8 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1Q | Para Recipiente de Mídia e Tubo de Mangueira |
| , Silicone, 7/32 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1E | Para Vaso de Mídia e Mangueira |
| Tubulação, Aço Inoxidável, 3/16 in OD | McMaster-Carr | 6100K164 | Para Vaso de Mídia e Tubulação de Mangueira |
| , Aço Inoxidável, 3/8 in OD | McMaster-Carr | 6100K161 | Para Recipiente de Mídia e |
| Conectores de Gancho | Fisher Scientific | 14-66-18Q | Para Vaso de Mídia e |
| Braçadeira de Catraca | Cole-Palmer | EW-06403-11 | Para Vaso de Mídia e Luer de Mangueira |
| , Fêmea | Cole-Palmer | EW-45512-34 | Para Vaso de Mídia e Mangueira |
| Luer, Macho | Cole-Palmer | EW-45513-04 | Para Vaso de Mídia e Mangueira |
| Filtro Millipore Aervent MTGR05010 62 mm, 0.2 μ m | Fisher Scientific | MTGR05010 | Para Vasos de Mídia e Mangueiras |
| Filtros PTFE Acrodisc CR 13 mm, 0.2 μ m | Fisher Scientific | NC9131037 | para vaso de mídia e mangueira |
| Tubo de fluxo de leitura direta para ar | Cole-Palmer | EW-32047-77 | Para configuração de gás nitrogênio |
| Tubo de fluxo de leitura direta para nitrogênio | Cole-Palmer | EW-32048-63 | Para configuração de gás nitrogênio |
| Proporcionador de gás Multitube Quadros | Cole-Palmer | EW-03218-50 | Para configuração |
| de gás nitrogênioRegulador, Airgas analítico de dois estágios | Y12-N145D580 | para configuração de gás nitrogênio | |
| Adaptador de mangueira, | Airgas | Y99-26450 | configuração de gás nitrogênio |
| Adaptador macho | Airgas | WES544 | para configuração de gás nitrogênio |
| Norprene Tubing | US Plastics | 57280 | para instalação de gás nitrogênio |
| Base de tripé | Cole-Palmer | EW-03218-58 | Para |
| Cartuchos de Válvula | Cole-Palmer | EW-03217-92 | Para Configuração de Gás Nitrogênio |
| Carboy 10 L | Fisher Scientific | 02-963-2A | Para Preparação de Mídia |
| Filtros de Topo de Garrafa de Vácuo Estéril Steritop, 1.000 ml, membrana PES; para tamanho de gargalo de 45 mm | Fisher Scientific | SCGP-T10-RE | Para Preparação de |
| Mídia Garrafa de 100 ml, tamanho | do gargalo de 45 mmFisher Scientific | FB-800-100 | Para Preparação de Mídia |
| cloreto de cálcio· 2H2O | Fisher Scientific | C79-500 | Reagentes de Mídia |
| cloreto de sódio | Fisher Scientific | BP358-1 | Reagentes de Mídia |
| sulfato de magnésio· 7H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Reagentes de |
| mídia fosfato de potássio monobásico | Fisher Scientific | AC424205000 | Media Reagentes |
| sulfato de amônio | Fisher Scientific | AC423400010 | Media Reagentes |
| cloreto de potássio | Sigma Aldrich | P9541 | Reagentes de mídia |
| ácido bórico | Sigma Aldrich | B6768 | Reagentes de Mídia |
| sulfato de cobre· 5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Reagentes de Mídia |
| iodeto de potássio | Sigma Aldrich | 60400 | Reagentes de Mídia |
| cloreto férrico· 6H2O | Reagentes de Mídia | Fisher Scientific | I88-100 |
| sulfato de manganês· H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Reagentes de |
| Mídia molibdato de sódio· 2H2O | Sigma Aldrich | M7634 | Reagentes de Mídia |
| sulfato de zinco· 7H2O | Fisher Scientific | Z68-500 | Reagentes de |
| Mídia biotina | Fisher Scientific | BP232-1 | Reagentes de |
| Mídia pantotenato de cálcio | Fisher Scientific | AC24330-1000 | Reagentes de Mídia |
| fólico | Sigma Aldrich | F7876 | Reagentes de Mídia |
| inositol (também conhecido como mio-inositol) | Fisher Scientific | AC12226-1000 | Reagentes de Mídia |
| niacina (também conhecido como ácido nicotínico) | Sigma Aldrich | N4126 | Reagentes de Mídia |
| ácido p-aminobenzóico | Fisher Scientific | AC14621-2500 | Reagentes de Mídia |
| piridoxina HCl | Sigma Aldrich | P9755 | Reagentes de Mídia |
| riboflavina | Sigma Aldrich | R4500-25G | Reagentes de Mídia |
| tiamina HCl | Reagentes | Mídia | Fisher Scientific BP892-100 |
| Leucina | Sigma Aldrich | L8000-100G | Reagentes de Mídia |
| Uracil | Sigma | Aldrich U0750 | Reagentes |
| Mídia Dextrose | Fisher Scientific | DF0155-08-5 | Reagentes de Mídia |
Referências
- Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. Growth of the Bacterial Cell. , Sinauer Associates, Inc. (1983).
- Cell Growth: Control of Cell Size. Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. , CSHL Press. (2004).
- Monod, J. La technique de culture continue, theorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950). <....
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Reimpressões e permissões
