Artigo de método

Optogenética ativação de neurônios Zebrafish somatossensoriais usando chef-tdTomato

DOI:

10.3791/50184

⸱

31 de janeiro de 2013

 , 
1Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Los Angeles

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenética técnicas tornaram possível estudar a contribuição dos neurónios específicos para o comportamento. Nós descrevemos um método em zebrafish larval para ativar neurônios individuais somatossensoriais expressando uma variante channelrodopsina (chef) com um diodo-bombeado do laser de estado sólido (DPSS) e registrando os comportamentos eliciados com uma câmera de vídeo de alta velocidade.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebrafish larvais estão a emergir como um modelo para descrever o desenvolvimento ea função de simples circuitos neurais. Devido à sua fertilização externa, o rápido desenvolvimento, e translucidez, peixe-zebra são particularmente bem adequados para as abordagens optogenética para investigar a função do circuito neural. Nesta abordagem, os canais de iões sensíveis à luz são expressos em neurónios específicos, permitindo que o experimentador para activar ou inibir-los à vontade e, assim, avaliar a sua contribuição para comportamentos específicos. A aplicação destes métodos em zebrafish larval é conceitualmente simples, mas exige a otimização de detalhes técnicos. Aqui demonstramos um procedimento para expressar uma variante channelrodopsina nos neurônios de larvas de zebrafish somatossensoriais, foto-ativação de células individuais, e registrando os comportamentos resultantes. Com a introdução de algumas modificações de métodos previamente estabelecidos, esta abordagem pode ser utilizada para eliciar respostas comportamentais de neurónios individuais activados atépara pelo menos 4 dias pós-fertilização (DPF). Especificamente, nós criamos um transgene usando um neurônio somatossensorial enhancer, CREST3, para dirigir a expressão do marcado channelrodopsina variante, chef-tdTomato. Injectar este transgene em células de embriões de uma-etapa resulta na expressão de mosaico em neurónios sensoriais, que podem ser visualizados por microscopia confocal. Illuminating identificaram células desses animais com a luz de um laser de 473 nm DPSS, guiado através de um cabo de fibra óptica, provoca comportamentos que podem ser gravados com uma câmera de vídeo de alta velocidade e analisados ​​quantitativamente. Esta técnica pode ser adaptada para comportamentos de estudo induzidas pela activação de qualquer neurónio de peixe zebra. Combinando esta abordagem com perturbações genéticas ou farmacológicas será uma forma poderosa para investigar a formação de circuito e função.

Introdução

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O desenvolvimento de métodos optogenética para promover ou inibir a excitabilidade neuronal com comprimentos de onda de luz definidos, tornou possível estudar a função de populações distintas de neurônios nos circuitos neurais que controlam o comportamento 1, 19, 21. Esta técnica é frequentemente usada para activar grupos de neurónios, mas também pode ser usado para activar os neurónios individuais. Larvas de peixe-zebra são particularmente sensíveis a estes métodos, uma vez que são translúcidos, o sistema nervoso se desenvolve rapidamente, e a criação de animais transgénicos é rápida e de rotina. No entanto, importantes barreiras técnicas devem ser superados para conseguir a ativação confiável único neurônio.

Para otimizar um processo de ativação dos neurônios optogenética zebrafish individuais, nós nos concentramos em neurônios somatossensoriais. Larvas do peixe detectar uma variedade de estímulos somatossensorial, utilizando duas populações de neurônios: os neurônios trigeminais, que inervam a cabeça, e Rohon Barba-(RB), que inervam neurónios do resto do corpo. Cada neurônio trigêmeo e RB projeta um axônio periférico que ramos extensivamente na pele para detectar estímulos e um axônio central que conecta a jusante circuitos neurais. Os animais respondem ao toque tão cedo quanto 21 horas pós-fertilização (hpf), indicando que os circuitos somatossensoriais coerentes formaram 5, 18. Durante o desenvolvimento das larvas, pelo menos, algum do trigémeo e RB sinapse neurônios na célula Mauthner para activar respostas de fuga clássicos, mas a acumular evidência sugere que há múltiplas classes de neurónios somatossensoriais com diferentes padrões de conectividade que podem suscitar variações sobre o comportamento de fuga 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. A motivação para o desenvolvimento deste método foi caracterizar a função comportamental de diferentes classes de neurónios sensoriais, mas esta abordagem poderia, em princípio, ser utilizado para estudar a função do neurónio ou quase qualquer população de neurónios no larval zebrafish.

Douglass et ai. Anteriormente descrito um método para a activação channelrodopsina-2-expressando neurônios somatossensoriais com luz azul, provocando o comportamento de escape 3. A sua abordagem utilizado um elemento potenciador do gene ISL1 para conduzir a expressão de CHR2-EYFP em neurónios somatossensorial. Este transgene, no entanto, foi relatado para exibir fluorescência relativamente fraco, o que requer a co-injecção de um segundo repórter, UAS :: GFP, para permitir a visualização das células que expressam CHR2-EYFP. Esta abordagem foi utilizada para obter respostas de comportamento entre 24-48 hpf, mas nunca poderia provocar uma resposta passado 72 hpf. Assim, embora este método funciona para estudar circuitos neurais em muito primeiros estágios larvais (24-48 hpf), é insuficiente para a caracterização de circuitos neurais e respostas comportamentais em larvas mais velhas, quando mais diversas respostas comportamentais são aparentes e os circuitos neurais são mais maduros.

Procuramosmelhorar a sensibilidade desta técnica, a fim de caracterizar a função de sub-populações de neurónios RB larvais. Para melhorar a expressão utilizou-se um intensificador somatossensorial específico (CREST3) 20 para conduzir a expressão de LexA-VP16 e um alongamento de sequências do operador LexA (4xLexAop) 11 para amplificar a expressão de um canal de fluorescência marcado activado pela luz. Esta configuração amplificado expressão do canal, eliminando a necessidade de co-expressão de um segundo repórter e que nos permite determinar directamente a abundância relativa do canal em cada neurónio. Usando a sequência de LexA / LexAOp tinha a vantagem adicional de permitir-nos introduzir o transgene em peixes-zebra linhas repórter que utilizam o sistema Gal4/UAS. A expressão transitória do transgene resultou em níveis variáveis ​​de expressão, mas era geralmente suficientemente robusto para visualizar o corpo da célula e as projecções axonais dos neurônios individuais ao longo de vários dias. Para otimizar a sensibilidadedade de luz que usamos a luz ativado canal chef, uma variante channelrodopsina consistindo de uma quimera de channelopsin-1 (Chop1) e channelopsin-2 (Chop2) com um site de cruzamento na hélice laço EF 13. Este canal é ativado no mesmo comprimento de onda chr2, mas requer menor intensidade de luz para ativação, tornando-a mais sensível do que outros canais comumente usados, incluindo chr2. A proteína chef foi fundida com a proteína fluorescente vermelha, tdTomato, permitindo-nos para a tela para a expressão da proteína sem ativar o canal. Como uma fonte de luz, foi utilizado um diodo bombeado laser de estado sólido (DPSS) acoplado a um cabo de fibra óptica para proporcionar uma precisa, pulso de alta potência de luz azul, para uma região específica da larva. Isto permitiu-nos concentrar a luz laser sobre neurónios individuais, eliminando a necessidade de encontrar raros animais transgénicos que expressam o canal num único neurónio. Usando essa abordagem, fomos capazes de ativar neurônios individuais RB, gravar resposta comportamentals com uma câmera de vídeo de alta velocidade, e os neurônios ativados imagem em alta resolução com microscopia confocal.

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Protocolo

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Preparar o seguinte antes do tempo.

1. Prepare cabo ótico

  1. Criar uma unidade de armazenamento para o cabo de fibra óptica por fusão do gargalo cónica de uma pipeta de Pasteur de vidro ao longo de um bico de Bunsen para criar um ângulo de ~ 150 °.
  2. Utilizando um cortador de fio ou uma lâmina de barbear, corte cuidadosamente o cabo de fibra óptica em duas partes. Cada peça deve ter uma extremidade com um FC / PC adaptador e uma extremidade exposta. Armazenar uma peça como um cabo de reserva.
  3. Descascar o cabo de fibra óptica para baixo para o revestimento através da remoção do revestimento de fibras e as fibras de reforço (Figura 1A), de 5,0 cm de corte de extremidade do cabo.
  4. Insira o cabo óptico no preparado Pasteur pipeta. Certifique-se de cabo pode facilmente entrar e sair da ponta da pipeta.
  5. Com cabo óptico saindo da ponta da pipeta Pasteur, corte cuidadosamente e retire revestimento de fibra de cerca de fibra de vidro, ~ 2 mm de corte final.
  6. Usando um cortador de diamante caneta / vidro, entalhe a fibra de vidro e quebrar off a fim de criar um corte limpo / superfície na extremidade da fibra (Figura 1B).
  7. Retrair cabo ótico em pipeta Pasteur para armazenamento. Repita o passo (1,6) se a ponta de fibra óptica fica lascado ou quebra de forma desigual.
  8. Cabo óptico de posição usando uma pipeta de Pasteur micromanipulador (Figura 1C).

Procedimentos 2-8 descrevem um método para a injecção em embriões de transgenes geralmente aplicáveis ​​a muitos experimentos zebrafish. Variações sobre este método, como as descritas em outros vídeos Jove 6, 7, 8, 9, 22 são igualmente eficazes.

2. Puxe agulhas de injeção

  1. Usando um extrator de agulha, puxar um tubo de vidro de borosilicato em duas agulhas de injeção com uma ponta gradualmente reduzida. Puller configurações irão variar. (Em um extrator agulha Sutter Instruments usamos configurações: P = 500 Calor, = 720, Pull = 50 Velocity, = 70 e Tempo = 150). Cada extrator agulha é diferente, assim otimizar as configurações do extrator lospirically. Para mais agulhas cónicas, aumentar o calor e / ou recepção. Para agulhas menos cônico, aumentar o tempo e / ou Pull diminuição.
  2. Agulhas guarde em um recipiente seguro (ou seja, uma placa de Petri com fita enrolada, para fora do lado adesivo).

3. Despeje moldes de injeção

  1. Derreta 0,5 g de agarose em 30 embrião ml / água azul, até agarose se dissolva completamente.
  2. Despeje a metade inferior de uma placa de Petri.
  3. Coloque o molde rectangular com poços de montagem (Figura 2) em agarose, tendo o cuidado de limitar a formação de bolhas em torno dos poços.
  4. Permitir agarose solidificar.
  5. Retire do molde eo placa de Petri com o azul / água embrião.
  6. Armazenar em posição vertical, enchido com água limpa, à temperatura ambiente para utilização no mesmo dia ou a 4 ° C para uso futuro.

4. Mix fazer DNA plasmídico para Injectáveis

  1. Diluir o ADN plasmídico até uma concentração de 50 ng / ul com vermelho de fenol a 1:10 em DDH 2 O. Paraexemplo:
    1,0 ml DNA plasmídeo (250 ng / ml)
    0,5 ml vermelho de fenol
    3,5 ml DDH 2 O
  2. Mistura de ADN podem ser mantidas à temperatura ambiente, se usar imediatamente ou armazenadas a 4 ° C durante vários dias.

5. Configure pares acasalados

Isto deve ser feito a noite antes que você pretende fazer injeções.

  1. Preencha tanques de criação com sistema de água e coloque peixes machos e fêmeas juntos. Se as injecções não pode ser realizada logo que as luzes mudam na instalação, peixe macho e fêmea com um divisor separado.

6. Prepare-se para Injeções (pode ser feito enquanto espera para embriões)

  1. Ligue pressão injetor plataforma. Verifique se o sistema está configurado para pulsar. Comece com o conjunto de duração de pulso a 1.
  2. Ligue a válvula de ar eAjuste a pressão injetor para ~ 20 psi.
  3. Usando um escopo de dissecação com a maior ampliação, quebrar a ponta da agulha com uma pinça ou uma póquer para criar uma abertura uM ~ 2 (Figura 3, Movie 1).
  4. Preencha agulhas com uma mistura de DNA por: 1. Colocação da agulha do lado da ponta, para cima, para a mistura de ADN e permitindo que a agulha preencher por acção capilar ou 2. Utilizando uma ponta de longo alcance para pipetar 1-2 ul do DNA misturar directamente para dentro da agulha.
  5. Lugar cheio de agulhas em um lugar seguro até que esteja pronto para injetar.

7. Coletar embriões

  1. Depois de luzes facilidade de ter ligado, remova divisores (se aplicável). Coletar embriões com um coador / peneira pequena e transferi-los para uma placa de Petri com o azul fresco / água embrião.

8. Injectar embriões no estágio de célula 1-2

  1. Transferir os embriões colhidos para moldes de injecção, utilizando uma pipeta de plástico.
  2. Usando um microscópio de dissecação, empurre embriões empoços com uma pinça ou um pôquer sem corte (Figura 4, filme 2).
  3. Coloque agulha carregada em um micromanipulador e posição sobre embriões.
  4. Calibrar o volume de injecção, ajustando a duração do pulso em um passo incrementos de até alcançar o volume desejado (~ 1 nl). Isto poderia ser calibrado com um micrómetro, como descrito em um vídeos anteriores Jove 8, 22, mas para esta precisão experiência não é necessária, uma vez que uma ampla gama de volumes de injecção irá resultar em expressão adequada.
  5. Injectar ~ 1 nl DNA misturar diretamente na célula e repita para todos os embriões. O ADN pode também ser injectado na gema de ovo, mas esta tende a ser menos eficientes (Figura 5, Movie 3).
  6. Remover embriões injetados de molde utilizando um fluxo suave de azul / água embrião.
  7. Loja injectado em embriões de 28,5 ° C no escuro.
  8. Remover não fertilizados, embriões danificados ou mortos periodicamente.
  9. Trate embriões wiª PTU entre 18-24 hpf para evitar a pigmentação.

9. Tela para a expressão do transgene

  1. Manualmente dechorionate 24-48 embriões HPF usando uma pinça.
  2. Anestesiar larvas usando 0,02% tricaina.
  3. Usando um microscópio de fluorescência de dissecação, identificar larvas com RB ou expressão neurônio trigêmeo e transferir para um novo prato com água fresca PTU azul / embrião. Embriões com expressão em células esparso facilmente identificáveis ​​são óptimas, mas neurónios individuais serão orientadas para a activação com um cabo de fibra óptica para uma ampla gama de densidade de expressão é aceitável.
  4. Embriões Armazenar a 28,5 ° C no escuro até desejada fase experimental.

10. Monte larvas para Experimentos Comportamento

  1. Faça 1,5% baixo derretimento de agarose em DDH 2 O e armazenar em um bloco de aquecimento 42 ° C para evitar que ele se solidifique.
  2. Utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro, a transferência de uma das larvas pré-rastreada para uma banheirae de 1,5% de agarose de fusão baixo, com água como azul / embrião pouco quanto possível.
  3. Transferir as larvas numa gota de agarose sobre uma placa de Petri pequenas.
  4. Sob um microscópio de dissecação, a posição se dorsal larva.
  5. Quando agarose solidificou, cortar a agarose com uma lâmina fina (# 11 bisturi), deixando uma cunha de agar em torno da larva inteira.
  6. Faça dois cortes diagonais em cada lado da gema, tomar cuidado para não nick da larva.
  7. Preencha a área em torno da agarose com embrião / água azul.
  8. Puxar agarose longe do tronco e cauda da larva (Figura 6).

11. Prepare alta velocidade da câmera e software de imagem

  1. Monte de alta velocidade da câmera para dissecar escopo.
  2. Conectar a câmera ao computador.
  3. Ligue o computador.
  4. Ligue de alta velocidade da câmera.
  5. Software de vídeo / imagem aberta (Usamos AOS software de imagem e descrever os procedimentos para usá-lo aqui, mas outra imagemsoftware é igualmente aceitável).
  6. Ajustar as configurações da câmera de acordo (ou seja, 1.000 quadros por segundo (fps), tampão de gatilho de 50% ou outras configurações preferenciais).
  7. Iniciar a gravação.

12. Ativar neurônios individuais usando um laser de 473 nm

  1. Anexar a laser estimulador e cabo óptico.
  2. Ligue estimulador.
  3. Definir estimulador a um máximo de 5 volts e com uma duração de pulso de 5 mseg.
  4. Ligar a laser de acordo com as instruções do fabricante.
  5. Usar um microscópio de dissecação para posicionar a ponta do cabo óptico próximo do corpo celular de um neurónio com Chef-tdTomato expressão (Figura 6).
  6. Entregar pulso de luz azul para ativar neurônio sensorial.
  7. Comportamento registro usando uma câmera de alta velocidade fixado em 500 ou 1.000 quadros por segundo.
  8. Repita experimento como desejado, espera 1 min entre cada activação para evitar a habituação. (Nós registramos um mínimo de três respostas para cada neurônio).
  9. Paralarvas lançamento, erguer além de agarose com uma pinça, tomando cuidado para não ferir o animal. Este animal pode ser permitido o desenvolvimento adicional e o processo pode ser repetido em uma fase mais antiga para caracterizar o desenvolvimento do comportamento. O embrião pode ser remontado de alta resolução de imagem confocal de células activadas para correlacionar o comportamento com a estrutura celular, tal como descrito abaixo.
  10. Transfira a larva placa de cultura com o azul fresco / água embrião. Nós usamos uma placa de 24 cavidades para controlar larvas individual.

13. Neuron imagem (s) com um microscópio Confocal

  1. Anestesiar larvas com tricaina 0,02%.
  2. Mount larvas, com o lado dorsal para cima, em 1,2% de agarose de fusão baixo ou de um molde dorsal.
  3. Imagem chef-tdTomato neurônios com um laser nm 543 e filtro adequado e objetivo. Usamos uma objetiva de 20x.
  4. Remover larvas de agarose e voltar ao indivíduo bem com o azul / água embrião.
  5. Armazenar a 28,5 ° C no escuro, para fuanálise rther.

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Resultados

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Figura 1. Cabo de fibra óptica configurar. (A) Camadas de um cabo de fibra óptica. (B) do cabo de fibra óptica descascado em uma pipeta Pasteur. (C) Cabo de fibra óptica em pipeta Pasteur posicionado usando um micromanipulador.

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Figura 2. Modelo de molde...

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Discussão

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Nós descrevemos uma abordagem para optogenética ativação de neurônios individuais em zebrafish RB ao vivo. Nosso método emprega transgenia transitória para expressar uma fluorescente etiquetado variante channelrodopsina, chef-tdTomato 13, em determinados neurônios somatossensoriais. Esta abordagem poderia ser facilmente adaptado para o uso em outras populações de células larvais zebrafish.

Usando essa abordagem, consistentemente induziu respostas comportamentais 34-48 larvas hpf e...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm qualquer interesse financeiro que faça concorrência.

Agradecimentos

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Agradecemos Fumi Kubo, Tod Thiele e HerwigBaier (UCSF / Max Planck Institute) para o conselho em experimentos de comportamento e de laser DPSS estabelecidos; Heesoo Kim e Chiara Cerri do Curso de Neurobiologia MBL para auxiliar na Chef-tdTomato experimentos; PetronellaKettunen (Universidade de Gotemburgo ) para colaboração inicial em experimentos optogenética; BaljitKhakh, Eric Hudson, Mike Baca e John Milligan (UCLA) para assessoria técnica, e Roger Tsien (UCSD) para o chef-tdTomato construir. Este trabalho foi financiado por uma concessão NRSA (5F31NS064817) para AMSP e uma bolsa da NSF (RIG: 0819010) para AS.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do reagente / Material Companhia Número de catálogo Comentários
Materiais
Pipeta de Pasteur de vidro Pescador 1367820B ou equivalente (10-15 mm de diâmetro)
200 fibra óptica mM Thorlabs AFS200/220Y-CUSTOM Patch Cord, Comprimento: 3 m, Acabar A: FC / PC End, B: FC / PC, Jacket: FT030
50 fibra óptica mM Thorlabs AFS50/125Y-CUSTOM Patch Cord, Comprimento: 3 m, Acabar A: FC / PC End, B: FC / PC, Jacket: FT030
Ferramenta de descascamento ajustável Thorlabs AFS900 Ferramenta ou três furos Stripping (FTS4)
Diamante escriba Wedge Thorlabs S90W
Flaming / Brown Micropipeta Puller Sutter Instruments P-97 ou equivalente
Tubo de vidro de borosilicato com filamento Sutter Instruments BF-100-78-10
Molde de injeção n / a n / a Figura 5
1,5 ml tubos de centrífuga Qualquer Qualquer
Placa de petri (100x15 mm) Qualquer Qualquer
Petri (60x15 mm) Qualquer Qualquer
Pressão injetor ASI MPPI-3 ou equivalente
Micromanipulador e metal estande Narashige M152 ou equivalente
Pipetas descartáveis ​​de plástico Fisherbrand 13-711-7 ou equivalente
Poker (titular Pin e pino Inseto) Multa Ciência Tools, Inc. 26018-17 e 26000-70 ou equivalente
Fórceps Multa Ciência Tools, Inc. 11255-20 ou equivalente
Microloader ponteiras Eppendorf 9300001007
28.5 ° C incubadora qualquer qualquer
42 ° C de calor bloco Qualquer Qualquer
Não-estéreis lâminas de bisturi # 11 Belas ferramentas científicas, Inc. 10011-00 ou equivalente
Dissecando slidar Zeiss Stemi ou equivalente
Fluorescente escopo de dissecação com filtro padrão Qualquer qualquer ou equivalente
Microscópio confocal Zeiss LSM 510 ou 710 ou objetivos equivalentes com lasers para GFP e RFP, e 10x, 20x e 40x
Câmera de alta velocidade AOS Technologies, Inc. X-PRI (130025-10) ou equivalente
473 nm laser portátil Lasers de cristal CL-473-050 ou poder superior, com opção TTL
S48 Estimulador Astro-Med, Inc. divisão Instrumento Grama S48K ou equivalente
FC PC / para FC / PC manga de acoplamento Thorlabs ADAFC1 Maio need para conexão de cabo óptico
Segurança Laser óculos Thorlabs LG10 ou equivalente
24 placas de cultura Genesee 25-102 ou equivalente
Solteiro lâminas depressão Pescador S175201 Ou equivalente
Reagente
Instant Ocean Ecossistemas Aquáticos IS50
Azul de metileno Pescador S71325
Vermelho de fenol Sigma P4758
Agarose EMD 2125 ou equivalente
Baixa Melt agarose Sigma A9045 ou equivalente
PTU Sigma P7629
Tricaina Sigma A5040
água / embrião azul 10 L DDH 2 O
0,6 g instantânea Oceano
6 gotas de metileno azul
vermelho de fenol (5 mg / ml em 0,2 M KCl)
100x PTU 0,150 g PTU
50 ml DDH 2 O
dissolver em 70 ° C, agitar frequentemente
alíquota e armazenar a -20 ° C
1x PTU 1 ml 100x PTU
99 ml de água azul / peixe
Tricaina solução estoque 400 mg tricaina
97,9 DDH 2 O
~ 2,1 ml de Tris 1M, pH9.0 ajustar o pH para 7,0 ~
armazenar em 4 ° C ou -20 ° C para armazenamento a longo prazo

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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