Optogenética estimulação do comportamento de fuga em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Resumo

Ferramentas optogenética codificados geneticamente permitir a manipulação não invasiva de neurónios específicos no Drosophila Cérebro. Tais ferramentas podem identificar neurónios cuja activação é suficiente para induzir ou suprimir determinados comportamentos. Aqui apresentamos um método para ativar Channelrhodopsin2 que se expressa em neurônios específicos em moscas livremente a pé.

Resumo

Um número crescente de ferramentas codificados geneticamente estão ficando disponíveis que permitem não invasivo manipulação da actividade neural de neurónios específicos em Drosophila melanogaster ^1. A principal delas são ferramentas optogenética, que permitem a ativação ou silenciamento de neurônios específicos no animal intacto, e movendo-se livremente com luz brilhante. Channelrodopsina (CHR2) é um canal de catião activado pela luz, que, quando activada pela luz azul, provoca a despolarização dos neurónios que expressam. Chr2 tem sido eficaz para a identificação de neurônios críticos para comportamentos específicos, tais como o CO ₂ evasão, extensão e tromba gigante de fibra resposta de sobressalto mediada ^2-4. No entanto, como as fontes de luz intensa, utilizados para estimular a CHR2 também estimular fotorreceptores, estas técnicas optogenética não tenham sido previamente utilizados no sistema visual. Aqui, nós combinamos uma abordagem optogenética com uma mutação que prejudica fototransdução a demonstrate que a ativação de um cluster de tear neurônios sensíveis em lobo óptico da mosca, foma-1 neurônios, pode dirigir um comportamento de fuga usado para evitar a colisão. Utilizou-se um alelo nulo de um componente crítico da cascata de fototransdução, fosfolipase C-β, codificada pelo gene norpA, para tornar a voa cego e também utilizar o Gal4-UAS sistema activador transcricional para comandar a expressão de CHR2 no Foma-1 neurônios. Moscas individuais são colocados em uma pequena plataforma cercada por LEDs azuis. Quando os LEDs são iluminadas, as moscas rapidamente descolagem em voo, de um modo semelhante ao comportamento visual impulsionada tear-escape. Nós acreditamos que esta técnica pode ser facilmente adaptada para analisar outros comportamentos em se movimentar livremente moscas.

Introdução

A crescente arsenal de ferramentas geneticamente codificados têm sido desenvolvidos para manipular actividade neural em células específicas na Drosophila melanogaster ^1. Estas ferramentas permitem a ativação não-invasiva ou silenciamento de neurônios específicos no animal intacto, e se movimentar livremente. Entre estes, Channelrhodopsin2 (CHR2), um canal de catião activado pela luz, apresenta vantagens importantes, uma vez que pode ser temporalmente controlado e rapidamente induzido. Quando os neurônios que expressam chr2 estão expostos a brilhante luz azul (470 nm), eles rapidamente despolarizar e apresentam elevadas taxas de disparo ^3-5. Ativação de neurônios como alvo específicos em animais livremente móveis revelou a suficiência de neurônios específicos para comportamentos como evitar CO ₂ ^3, tromba extensão ^2,4, ea gigante de fibra respostas de alarme mediadas ^4. No entanto, como as fontes de luz intensa necessárias para estimular CHR2 também estimular fotorreceptores, aplicando optogenetic técnicas para o sistema visual tem sido limitada. Através da combinação de uma abordagem optogenética com uma mutação que prejudica a fototransdução, nós demonstramos que a activação de um conjunto específico de neurónios no lóbulo óptico da mosca pode conduzir a um comportamento de escape utilizado para evitar a colisão ^6.

A maioria, se não todos, os animais visuais exibem um comportamento de fuga para evitar colisões com objectos que se aproximam. Andar a pé ou parado moscas, quando se apresenta com uma colisão iminente, o arranque em vôo, longe da colisão iminente ^7-9. Estes decolagens caracterizam-se por asas levantadas antes da descolagem e uma trajetória de vôo instável ^10,11. Esta resposta é distinto do gigante fibra resposta mediada sobressalto, saltos que não são precedidos por asas levantados, e, normalmente, resultaria em uma queda em queda livre ^4,9. Tendo identificado um cluster específico de neurônios sensíveis tear no lobo óptico, Foma-1 neurônios, que são uniquely atento para codificar objetos que se aproximam, procurou-se investigar o seu envolvimento na mosca comportamento de fuga tear. Aqui demonstramos o uso de optogenética para ativar seletivamente esses neurônios e provocar o comportamento da mosca fuga.

Usamos o Gal4-UAS sistema activador transcricional de dirigir a expressão de CHR2-nos uma foma neurónios. Chr2 requer o co-fator todo-trans-retinal e como esta é encontrada em níveis baixos no sistema central nervoso Drosophila deve ser completado na dieta das moscas. ^3,4 Como a luz brilhante é usado para ativar chr2 e moscas exibem comportamentos phototactic fortes ^12, procurou-se eliminar a possibilidade de uma resposta visual ao estímulo. Para fazer isto, utilizou-se animais que eram mutantes homozigóticos para um alelo nulo do gene norpA, que codifica um componente crítico da cascata de fototransdução, fosfolipase C-β. Fotorreceptores em tais moscas mutantes são incapazes de responsabilidaded a luz ^13. Para testar a estimulação optogenética da resposta de fuga, é necessário isolar uma única mosca e banhar em luz azul brilhante. Para fazer isso, nós colocamos moscas individuais em pontas de pipeta. Uma ponta de pipeta é colocada num suporte personalizado, de tal modo que a mosca vai geotactically subida da ponta e para fora para uma plataforma rectangular. A mosca é capaz de caminhar livremente em cima desta plataforma. A plataforma está rodeada por quatro matrizes de LED azul, cada um contendo três LEDs, voltadas para o topo da plataforma. Depois da passagem está na plataforma, os LEDs são iluminados, e resposta da mosca é gravado usando uma câmera de alta velocidade ^6.

Protocolo

1. Gerar Moscas channelrodopsina

1. Cruz UAS-chr2 moscas com o motorista Gal4 de sua escolha, nós usamos G105-Gal4, que é expressa em foma-1 neurônios no lóbulo óptico.
2. Para eliminar a possibilidade de uma resposta visual para o estímulo de luz azul, ambas as linhas de mosca são em aw fundo norpA ^+.
3. Resultado final: w ⁺ norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
4. Depois de moscas adultas eclose, colocar as fêmeas seleccionadas com alimento fresco, suplementado com 10 uM todo-trans-retinal (um co-factor necessário para a CHR2) e protegida da luz, durante 3 dias antes da realização do ensaio do comportamento.

2. Faça 10 Comida All-trans-retinal mM aprimorada

1. Dissolver 100 mg de ácido todo-trans-retinal em 17,6 ml de etanol a 95% para tornar a 20 mM na retina. Manter todo-trans-retinal ao abrigo da luz em todos os momentos.
2. Derreta alimentos mosca padrão fubá no microondas, e deixe esfriar até que fique quente ao toque.
3. Misturar 50 ul de 20 mMall-trans-retinal em frascos de 10 ml de comida mosca.
4. Deixe arrefecer os frascos e manter ao abrigo da luz.

3. Equipamento

1. Pontas de pipeta: Standard 1.000 pontas de pipeta uL são cortados perto da ponta, criando um diâmetro de poro de ~ 2,25 mm.
2. Da plataforma (ver figura 1).
   1. Uma base de Delrin, 17 cm x 25 cm, foi construído com orifícios roscados em cada canto para encaixar ¼ "NPT conectores de mangueira de arrefecimento.
   2. Um suporte vertical, feito de Delrin, está ligado ao centro da base. As dimensões totais são de 25 mm x 40 mm x 65 mm (largura x profundidade x altura). A ranhura 10 mm de largura corre o comprimento do suporte, com um parafuso de polegar na parte inferior. A plataforma está ligada à parte superior do suporte, 25 mm X 40 mm X 10 mm, com um furo de 3,5 mm de diâmetro alinhado com a ranhura no suporte.
3. Matrizes de LED (ver Figura 1).
   1. Quatro braços de Refrigeração, ~ 18 cm de comprimento, estão afixadas na plataforma base utilizando o conector da mangueira de líquido refrigerante. Refrigeração é usado apenas como um suporte estrutural e não é utilizado para fins de refrigeração.
   2. Ranhuras espaçadas adequadamente são cortadas na parte final do refrigerante mangueira de cada braço para fixar um dissipador de calor para a extremidade de cada braço.
   3. A Rebel LED azul Tri-Stars é montada a cada dissipador de calor através de pré-corte de fita adesiva térmica. A CARCLO 18 ° Tri-lente é afixada em cada Tri Star.
   4. LED Tri-Stars são ligados aos motoristas BuckPuck DC e uma fonte de alimentação, conforme especificado. Nós conseguimos o nosso set-up com cada BuckPuck ligar duas Tri-Stars em série.
   5. Iluminação de todos os quatro LED Tri-estrelas a 700 mA rendeu uma irradiação de 713 W / m ² na nossa plataforma.
4. Câmara: A câmara está montada num tripé pequeno e centrou-se na parte superior da plataforma.

4. Ensaio Comportamental

1. Resumidamente anestesiar moscas em gelo.
2. Coloque moscas individuais em pontas de pipeta, usando a fita para fecharambas as extremidades da ponta.
3. Após as moscas têm despertado e estão activamente a explorar a ponta da pipeta, retirar a fita adesiva e coloque uma pipeta na ranhura no suporte vertical. O parafuso de aperto manual é usado para proteger a ponta da pipeta no lugar e para fechar a parte inferior da ponta.
4. Como a mosca explora a ponta da pipeta (tipicamente 30 - 60 seg), iniciar a gravação da câmara imediatamente antes da mosca emerge da ponta para cima da plataforma.
5. Após a mosca surgiu na plataforma, espere 1-2 seco, e ligar os LEDs azul. Use um cronômetro para medir manualmente o tempo até que a mosca inicia vôo.

Resultados

Cego voa manifestou o chr2 ou o driver G105 só mostram uma baixa taxa de decolagem após a sua iluminação com luz azul brilhante. Cego moscas apresentaram a mesma taxa de descolagem independentemente de iluminação (Figura 2), sugerindo que estes eram take-off espontânea e não devido à iluminação com luz azul. Quando o CHR2 é expressa nos neurónios Foma1, no entanto, a iluminação com luz azul elicia a resposta de fuga. Mais de 50% das moscas testados tirou dentro de 1 segundo de iluminação e de 75% dentro...

Discussão

Nós demonstramos estimulação optogenética de comportamentos de fuga, banhando livremente caminhar moscas em luz azul brilhante. Esta abordagem pode ser facilmente adaptada para analisar outros comportamentos em moscas livremente a pé, e pode ser escalado para plataformas maiores, simplesmente ladrilhos as matrizes de LED que usamos em uma área maior. Usando uma câmera barata do que descrever, ou outros sistemas de câmera disponíveis, o usuário pode ajustar a taxa de quadros e resolução espacial das imagens adquiri...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
			Reagente
All-trans retinal	O avanço científico & Chemical Inc	R3041
			Equipamento
Dissipador de calor de 9,2 C / W	Luxeonstar	LPD30-30B	30 milímetros quadrados X 30 mm de altura
CARCLO 18 ° Tri-Lens	Luxeonstar	10507
Rebelde LED azul na Tri-Star Base de	Luxeonstar	MR-B0030-20T	470 nm, 174 lm @ 700 mA.
700 mA BuckPuck driver DC	Luxeonstar	3021-DE-700
Cablagem para Driver BuckPuck	Luxeonstar	3021-HE
Pré-corte da fita adesiva térmica	Luxeonstar	LXT-S-12	Base de dados de 20 milímetros Hex
Snap-Loc Refrigeração, ¼ "ID	McMaster-Carr	5307K49
Snap-Loc Conector Refrigeração	McMaster-Carr	5307K39	¼ "NPT
Laboratório Grau Switching Mode Power Supply DC programável	BK Precision	1698
Exilim câmera	Casio	EX-FH20