Lapso de tempo de imagem é utilizado para avaliar o comportamento dos principais pré-neoplásicas células epiteliais mamárias derivados de modelos de ratos geneticamente modificados de risco de câncer de mama para determinar se há correlação entre os parâmetros específicos de comportamento e distintas lesões genéticas.
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Artigo de método
Lapso de tempo de imagem de pré-neoplásicas primárias células epiteliais mamárias derivados de modelos de rato geneticamente modificado do cancro da mama
Neste artigo
Resumo
Resumo
Lapso de tempo de imagem pode ser utilizada para comparar o comportamento de culturas primárias células epiteliais mamarias pré-neoplásicas derivadas de diferentes modelos de ratos geneticamente modificados de cancro da mama. Por exemplo, o tempo entre as divisões celulares (tempo de vida das células), os números de células apoptóticas, a evolução de alterações morfológicas, e mecanismo de formação de colónias pode ser quantificada e comparada em células portadoras de lesões genéticas específicas. Primários mamárias culturas de células epiteliais são gerados a partir de glândulas mamarias sem tumor palpável. Glândulas são cuidadosamente ressecada com clara separação de músculo adjacente, os nódulos linfáticos são removidas, e as suspensões de célula única de células epiteliais mamárias enriquecidos são gerados pelo tecido mamário trituração seguida por dissociação enzimática e filtração. Unicelulares suspensões são banhados e colocado diretamente sob um microscópio dentro de uma câmara incubadora para live-célula de imagem. Dezasseis 650 x 700 uM campos uM numa configuração 4x4 de cada well de uma placa de 6 poços são gravadas a cada 15 min, durante 5 dias. Lapso de tempo imagens são examinados diretamente para medir comportamentos celulares que podem incluir mecanismo ea freqüência de formação de colônias de células dentro da 24 hora antes de plaqueamento as células (agregação contra a proliferação de células), a incidência de apoptose, e faseamento de alterações morfológicas. De uma única célula de rastreamento é utilizada para gerar mapas de células destino para a medição de tempos de vida de células individuais e investigação de padrões de divisão celular. Os dados quantitativos foram analisados estatisticamente para determinar as diferenças significativas no comportamento correlacionados com lesões genéticas.
Introdução
Modelos de ratos geneticamente modificados são ferramentas para estudar e entender como diferentes lesões genéticas contribuem para o risco de desenvolver câncer de mama. Por exemplo, ratos geneticamente modificados demonstraram que a combinação de três factores: a perda da mama de comprimento completo cancro 1, o início precoce (BRCA1) gene em células epiteliais mamarias, a proteína p53 do tumor (TP53) da linha germinal haploinsuficiência, e epitelial mamaria célula alvo-regulada alfa do receptor de estrogénio (ERa) resultados de expressão no desenvolvimento de cancro da mama em 100% de BRCA1 floxed (f) 11/f11/Mouse vírus do tumor mamário (MMTV) -Cre/p53 -/tetracycline-operator + / ( tet-op) -ER/MMTV-reverse tetraciclina transativador (camundongos rtTA por 12 meses de idade, em comparação com as percentagens mais baixas relatadas em BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / - ratos sem ERa sobre-expressão (~ 50 - 60%) e ratos BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre sem TP53 haploinsufência (<5%) 1.
Imagiologia de lapso de tempo dinâmico do comportamento de pré-neoplásicas primárias células epiteliais mamárias revela diferenças no comportamento de células que são menos facilmente apreciados em secções de tecido de estática. Alterações na proliferação e diferenciação são observados nos principais células mamárias de portadores da mutação BRCA1 humanos. 2 Criação de uma única célula suspensões de células epiteliais mamárias primárias do normal e ratos geneticamente modificados são gerados através de dissociação enzimática de ressecado tecido da glândula mamária. 3 Time-lapse as imagens são vistas mecanismo para avaliar e tempo de aparecimento de células colônia e incidência de alterações morfológicas em células incluindo transição epitelial-mesenquimal (EMT) e apoptose. Geração de mapas de destino celular, a quantificação da duração de tempo entre as divisões celulares (tempo de vida das células), e determinação de padrões de divisão celular são facilitadas pela utilização de uma única célula de controlo. TimmFerramenta de Acompanhamento 's (TTT) é um software disponível publicamente usada para gerar mapas de uma única célula destino. A sua utilidade na elucidação dos mecanismos de destino celular foi estabelecida a 4,5 examinar o desenvolvimento normal das células-tronco hematopoiéticas 6-9 e a geração de neurônios 10.
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Protocolo
1. Esquema geral
- Gerar culturas primárias de células epiteliais mamarias pré-neoplásicas de glândulas mamárias de engenharia genética e de controlar a ratinhos de tipo selvagem.
- Capturar imagens ao vivo de células a cada 15 minutos utilizando Volocity software de aquisição de imagem (versão 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) para um máximo de 5 dias.
- Ver lapso de tempo imagens diretamente para avaliar tempo e mecanismo de formação das células epiteliais colônia, a incidência de apoptose, e faseamento de alterações morfológicas.
- Converta pilhas Volocity gerado. TIFF. Arquivos JPG usando MetaMorph Automação Microscopia e Software Image Analysis (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) e renomear arquivos de imagem digital (Rename 2.1.6, http://www.softpedia.com/get / / Sistema de gerenciamento de arquivos / A-Rename.shtml ) para permitir a compatibilidade com software Timm ferramenta de rastreamento (TTT,tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html "target =" _blank "> http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html).
- Usando TTT, gerar mapas de células destino para determinação do tempo entre as divisões celulares (tempo de vida das células) e os padrões de divisão celular (simétrica em relação assimétrica).
- Analisar os dados quantitativos das etapas 3 e 5 para determinar se existem diferenças estatisticamente significativas entre os diferentes modelos de ratos geneticamente modificados e / ou tipo selvagem controles.
2. Geração de primárias culturas de células epiteliais mamárias
- Preparar meio completo para o isolamento de células epiteliais mamarias individuais após uma variação de instruções do fabricante (EpiCult-B Rato Médio Kit, Stemcell Technologies, Vancouver, BC). Combinar 450 mL de meio Epi-Cult-B, 50 ml Epi-B Cult suplemento proliferação, 5% de soro fetal bovino (FBS), 50 ug / ml de Penicilina / Estreptomicina (PenStrep) e 10 ng / ml de factor de crescimento epidérmico (EGF).
- Prepare Dissociação dos meios por combinação de 1 parte de uma mistura de colagenase / hialuronidase 10x com 9 partes de meio completo a partir de 2.1.
- Euthanize mouse e imediatamente proceder a autópsia. Lugar do mouse em suas costas em uma plataforma de necropsia isopor e proteger todos os quatro membros para pele ventral é tenso. Saturar a pele ventral e do cabelo, incluindo a que recobre as extremidades, com etanol a 70%. Expor # 2/3 (torácica) e # 4/5 (inguinal) glândulas mamárias, fazendo uma incisão na linha média através da pele (não inserir o peritoneu), que é estendido para um Y-incisão através da pele medial de cada membro dianteiro e uma cabeça para baixo incisão através da pele Y medial de cada membro posterior.
- Usando dissecção romba, separar a pele do underlyingperitoneum, puxe ambos os lados da pele até que é tenso, e fixá-lo para a plataforma de necropsia isopor usando pinos. A partir do lado exterior, utilize dissecção romba com o uso judicioso de Dissection tesoura para isolar o inguinal intacta e / ou torácica glândulas mamárias de tecido conjuntivo subjacente e muscular. Coloque no máximo duas glândulas mamárias em uma placa de Petri 10 centímetros estéril e passar para a capa de cultura de tecidos.
- Na capa de cultura de tecido, examinar as glândulas mamárias para os gânglios linfáticos que são identificadas como de pequeno porte, bem circunscritos nódulos com uma cor amarelada. Remover os linfonodos da glândula circundante usando bisturi e pinças esterilizadas. Picar tecido mamário em ~ 1 mm 3 cubos usando dois bisturis estéreis, uma em cada mão.
- Lugar picada tecido mamário em 5 ml de dissociação Media, misturar suavemente pipetando para cima e para baixo 2-3 vezes utilizando uma pipeta de 10 ml, e incuba-se durante a noite (até ~ 16 horas) numa incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 numa 50 tubo ml com tampa solta.
- Na manhã seguinte, preparar uma mistura fria de solução de 1 parte de Hanks Balanced Salt (HBSS) contendo 2% de FBS e 4 partes de solução de cloreto de amónio tamponado para promover vermelho blood lise celular (HFAmCl), bem como HBSS frio suplementado com FBS 2% (IC). Pré-aquecido Tripsina-EDTA (0,25%), 5 mg / ml em solução Dispase Salina Equilibrada de Hank Modificado, 1 mg / ml de DNase I, e meio completo.
- Remover o tubo de centrifugação cónico com o tecido mamário da incubadora e suavemente pulsar vortex 2-3 segundos duas vezes. Centrifuga-se o tubo a 450 x g durante 5 min (temperatura ambiente ou a 4 ° C), e desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento em um mínimo de 10 HFAmCl ml e centrifugar a 450 xg durante 5 min (temperatura ambiente ou a 4 ° C) e eliminar o sobrenadante.
- Adicionar 3 ml de tripsina-EDTA para o pelete e misturar em primeiro lugar com uma pipeta de 5 ml e, em seguida, com uma micropipeta P1000 até fibroso (min 1-3). Adicionam-se 10 ml de HF, de centrifugação a 450 x g durante 5 min (temperatura ambiente ou a 4 ° C) e descartar o sobrenadante.
- Adicionar 2 ml da solução 5 mg / ml e Dispase 200 ul de 1 mg / ml de DNase I do pellet e misture com uma micropipeta P1000 durante 1 min. Amostra deve ser cloUdy mas não pegajoso. Se pegajoso, adicionar 100 ul de DNase I e misturar novamente.
- Adicionam-se 10 ml de HF a frio, a tensão através de um filtro de células 40 um e centrifugar a 450 xg durante 5 min (temperatura ambiente ou a 4 ° C) e eliminar o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento final em mídia completo. Quantificar o número total de células (utilizando um hemocitómetro ou Coulter Counter). Duas glândulas mamárias produzir cerca de 1 x 10 6 a 1 x 10 7 células. Placa primárias de células epiteliais de um plano de fundo da placa de 6 poços a uma densidade de 1,5 x 10 5 células por poço.
3. Live-célula de imagem
- Imediatamente após o plaqueamento das células, colocar a placa de 6 poços com segurança sobre uma platina do microscópio dentro de um 5% de CO 2 / saturado humidity/37 ° C câmara de incubação de temperatura. Ajustar o condensador por Kohler iluminação e do centro dos anéis de fase. Para as experiências apresentadas aqui, uma invertida Nikon Eclipse TE300/PerkinElmer Spinning Disc Confocalsistema de microscópio de campo amplo modo de contraste de fase com uma lente objectiva de 10x foi usado.
- Software de aquisição de imagem aberta, criar e nomear uma biblioteca para as imagens de lapso de tempo, e salvar em um local com espaço suficiente para arquivos grandes. As experiências apresentadas aqui utilizado Volocity software de aquisição de imagem (versão 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA).
- Permitir que a placa se equilibrar no microscópio incubadora durante um mínimo de 15 min. Abaixe as lentes para evitar fase lente-interferência. Sob o "Palco" título, selecione "Calibrar Estágio". Readquirir o plano focal conjunto, Z = zero nos pontos x, y, z guia e marca de imagem, selecionando "Adicionar ponto" sob o "Stage" de título. Pontos lugar no meio de cada poço da placa de 6 poços para imagens de contraste de fase como de imagem pode ser distorcida, perto da periferia de poços de plástico. Organizar pontos em uma praça em 4 x 4 campos (650 um x 700 campos mm), cada um com uma pequena sobreposição (cerca de 5%). Guardar os pontos selecionados em "Stage. "
- Em "Palco" selecione "Make mapa foco" e siga as instruções para definir o foco de cada ponto. Definir tempo de aquisição de imagem para capturar imagens 4 por hora (a cada 15 minutos). Isto pode ser ajustado de acordo com os requisitos da experiência específica. Salvar o mapa foco em "Palco".
- Botão direito do mouse no lado direito da ferramenta bar "Aquisição de Imagem" e salvar as configurações de imagem. Pressione o botão de gravação para iniciar a imagem. Depois de 1 hora, verifique o foco das imagens para ver se algum ajuste é necessário.
- Monitorar e continuar imagem ao vivo, durante 5 dias, que termina quando as células se tornam confluentes.
4. A visualização direta dos lapso de tempo imagens para avaliar Timing e mecanismo de formação da colônia de células epiteliais inicial, a incidência de apoptose, e retirada de alterações morfológicas
- A visualização direta dos lapso de tempo imagens podem ser realizando utilizando qualquer software de visualização de vídeo compatível (por exemplo, http:/ / Www.real.com/ realplayer ou software freeware ou disponíveis comercialmente outro). As imagens podem ser vistas em. Formato TIFF nesta etapa ou após a conversão para. Arquivos JPG (ver Passo 5).
- Para determinar mecanismo de formação da colônia inicial, começar com uma única pilha-imagem representando um site de imagens sobre a placa. Em quadros inicial, as células irão ser flutuante. Siga imagens seriais para determinar quando a primeira célula epitelial adere à placa. Neste passo, as células epiteliais podem ser identificada e diferenciada de fibroblastos por sua morfologia cubóide mais. Siga esta única célula epitelial através de imagens em série e seguir seu destino sobre o 24 hora subseqüente. Gravar se torna-se rodeada por outras células epiteliais ou submetido a divisão celular ou a apoptose. Se rodeada por células epiteliais, o mecanismo de formação de colónias pode ser determinada directamente através da visualização se as células vizinhas são derivadas de células flutuantes, que, em seguida, dos agregados com a célula inicial aderente (s) oua partir da divisão da célula inicial aderente. Anote o número de colônias formadas por agregação de células versus divisão celular durante a primeira hora 24.
- Para determinar o número de células inicialmente aderentes que sofrem apoptose, durante um período de tempo específico, siga imagens seriais para o aparecimento de características clássicas de desenvolvimento da apoptose numa célula que tenha sido aderente ( http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html ), e o número de células apoptóticas identificados durante a totalidade da duração da imagiologia ou dentro de períodos de tempo específicos registados.
- Ao longo do tempo, as células epiteliais em cultura de alterar a sua morfologia de uma forma cuboidal inicial para um aspecto mais alongado consistente com EMT. Siga imagens de série para determinar o dia / hora após o plaqueamento, quando isso ocorre.
5. Modificação do arquivo de imagem
- Através do software Volocity, exportar os arquivos de imagem TIFF pilhas. Aqui Automação Microscopia MetaMorph & Software Análise de Imagem (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) foi usado para abrir os arquivos TIFF pilha e eles foram salvos em MetaMorph como individuais. Imagens JPG.
- Renomear as pastas e arquivos de imagem de acordo com os requisitos de software Timm ferramenta de rastreamento Use um programa de freeware como A Rename 2.1.6 ( http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml ) para renomear arquivos em grupos. Criar uma pasta que contém todas as pastas e arquivos do experimento e nomear a pasta (por exemplo, EXPERIMENTNAME).
- Criar uma subpasta para cada ponto / posição onde a cultura foi fotografada. Nomear as subpastas: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. O número da posição deve ter 3 dígitos. Exemplo: 072511RN_p001. Coloque todos os arquivos de imagem de que a posição individual na subpasta.
- Adicionar o instante de tempo (usando 5 dígitos) e número de canal (uma vez que existe apenas um canal de campo claro, utilizar "0"), no final de cada nome de arquivo neste formato:
EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg - Gerar um arquivo de log para cada posição, primeiro fazer o download do programa TTTlogfileconverter gratuito no site da FPF. Inicie o programa TTTlogfileconverter e selecione a pasta experimento. Introduzir um intervalo de imagem (em segundos). Para uma foto tirada a cada 15 minutos, entre 900 seg. Em seguida, pressione o botão verde secreto log arquivos.
6. Geração de mapas de celulares destino das células único usando TTT
- Create uma pasta chamada TTTexport e uma subpasta chamada TTTfiles onde todos os dados de rastreamento de células serão armazenados seguindo as instruções de software TTT
- Inicie o programa de TTT, selecione as iniciais do usuário, e clique em "Continuar".
- Pressione a tecla "Set NAS", selecione o usuário criado "TTTexport" pasta e clique em OK. No navegador, selecione uma pasta experimento, selecione uma pasta de posição e pressione "Load posição" botão.
- Definir fator ocular para "10x". Carregar o número de imagens necessárias (carga de todas as imagens é recomendado pela primeira vez).
- Na janela de edição de célula, selecione "colônia Nova" no menu Arquivo. Na janela de vídeo, prima a "célula Track" ou F2 para começar a acompanhar um celular.
- Identificar uma célula na Movie janela e use o mouse para colocar o cursor sobre a célula. Um círculo com o número de célula deve aparecer após F2 foi clicado. Use a tecla "0" no teclado numérico do teclado para controlar o posicionamento da célula e avançar para a próxima imagem. Mover o cursor para seguir a posição de cada célula em cada frame. Para excluir uma faixa e retornar à imagem anterior pressione "Del" no teclado numérico. Para mover os quadros para a frente sem o acompanhamento da imprensa célula "3", e para se mover para trás sem o acompanhamento pressione "1" no teclado numérico.
- Para marcar uma divisão celular clique em "Divisão" botão na janela do filme. Para marcar a morte celular, clique no "Cell morte" botão na janela do filme. Uma vez que a divisão ocorreu, as células-filhas podem ser rastreadas no mesmo mapa célula destino com o botão direito sobre o símbolo círculo da célula-filha designado na janela do editor de célula para começar a controlar o modo automaticamente.
- Pressione F10 para salvar a árvore. Cada árvore vai economizar, a saída de dobra designadoer (TTTExport). Para iniciar um mapa novo destino da célula, selecione "nova colônia" sob o "Arquivo" e depois menu "Abrir" na janela do editor Cell.
- Tabular os dados da vida após a coleta de células a partir da guia "Cell dados" na janela do editor Cell.
7. Análises Estatísticas
- Utilize um teste t de Student (se comparar dois genótipos) ou ANOVA (se comparando> dois genótipos) para determinar se diferenças nos dados paramétricos, tais como o número de colônias de células iniciais, vidas celulares ou horas até o aparecimento de EMT entre os diferentes genótipos são estatisticamente significativo. Frequência apoptótico pode ser comparado como o número / número total de células banhados usando t de Student ou ANOVA-teste ou com o teste de Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis, quando calculado como uma percentagem de células aderentes.
- Realizar testes de potência utilizando dados a partir de análises de experimentos iniciais para determinar quantas experimental replica precisa realizados e mapas gerados a partir de células de destino cada repetição para s adequadapoder tatistical usando freeware disponíveis (por exemplo http://statpages.org/ ). Nos experimentos apresentados aqui, as culturas de células derivadas de três ratos por genótipo foram suficientes para determinar se houve diferenças estatisticamente significativas na formação de células colônia e vidas celulares quando específicos modificações genéticas foram feitas.
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Resultados
As células epiteliais e de fibroblastos podem ser distinguidos pela morfologia celular. As células epiteliais tem uma forma cuboidal (Figura 1A-B) e formam colónias de células (Figura 1A). Fibroblastos, um tipo de células do estroma, têm uma morfologia alongada (Figura 1C).
As células foram reunidas e flutuando no início da imagiologia (Figura 2A-D). Após a ligação à placa plana e tornaram-se demonstrado um aspecto cuboidal-...
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Discussão
Etapas críticas
É importante assegurar que as glândulas mamárias são colhidas a partir de ratos da mesma idade para controlar a variabilidade relacionada com a idade no comportamento da célula epitelial mamaria. Quando plaqueamento das células, o mesmo número de células devem ser semeadas em cada poço de cada experimento. As células devem ser relativamente esparsa quando plaqueamento de modo a que as culturas não se tornam confluentes muito rapidamente tornando-se possível seguir várias células...
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Bofan Wu e Christian Raithel de assistência técnica e Rieger Michael para a sua introdução para live-célula de imagem. Apoiado pelo NCI, RO1CA112176 NIH (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN), Departamento de Defesa W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU programa (World Class University), através da Fundação de Pesquisa Nacional da Coreia, financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (R31-10069) (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (Roedor Equipamentos Facilidade Barreira), e NIH NCI 5P30CA051008 (Microscopia e Imagem e Animal Recursos Compartilhados).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| EpiCult B-Rato Meio Basal | StemCell Technologies | 05610 | |
| EpiCult-B Proliferação Rato Suplementos | StemCell Technologies | 05612 | |
| recombinante fator de crescimento epidérmico humano (rhEGF) | StemCell Technologies | 02633 | |
| Colagenase / Hialuronidase | StemCell Technologies | 07912 | |
| Scapels descartáveis | Pena | 2975 # 10 | |
| Solução salina equilibrada de Hanks | StemCell Technologies | 37150 | |
| ACloreto mmonium | StemCell Technologies | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | StemCell Technologies | 07901 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 07913 | |
| DNase I | StemCell Technologies | 07900 | |
| 40 filtro de células mM | StemCell Technologies | 27305 | |
| FBS | StemCell Technologies | 06100 | |
| PenStrep | Gibco | 15140 |
Referências
- Jones, L. P., et al. Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer. Oncogene. 27, 794-802 (2008).
- Burga, L. N., et al. Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers. Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).
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- Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453, 345-351 (2008).
- Schroeder, T. Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells. Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).
- Eilken, H. M., Nishikawa, S. -I., Schroeder, T. Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium. Nature. 457, 896-900 (2009).
- Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level. Current opinion in hematology. , (2012).
- Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice. Science. 325, 217-218 (2009).
- Rieger, M. A., Schroeder, T. Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines. Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
