Este artigo descreve a preparação do tecido acabado de melanoma obtidas em culturas primárias de células, e como para remover contaminações de eritrócitos e fibroblastos a partir de células tumorais. Finalmente, descrevemos como CD133 + De células estaminais putativas de melanoma são classificados do CD133 - Massa usando separação celular magnética activado (MACS).
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Artigo de método
Cultura de Células e Isolamento paciente Derivado de CD133
Neste artigo
Resumo
Resumo
Apesar de melhores opções de tratamentos para o melanoma disponível hoje, os pacientes com melanoma maligno avançado ainda tem um prognóstico ruim de sobrevivência livre de progressão e global. Portanto, a pesquisa translacional precisa fornecer mais evidências molecular para melhorar terapias direcionadas para melanomas malignos. No passado, os mecanismos de oncogénicos relacionadas com melanoma foram extensivamente estudados em linhas celulares estabelecidas. No caminho para tratamentos mais personalizados baseados em perfis genéticos individuais, propomos usar linhas celulares derivadas paciente em vez de linhas celulares genéricos. Juntamente com os dados clínicos de alta qualidade, especialmente no acompanhamento do paciente, essas células serão fundamentais para compreender melhor os mecanismos moleculares por trás de progressão do melanoma.
Aqui, nós relatamos o estabelecimento de culturas primárias de melanoma tecido tumoral dissecados fresco. Este procedimento inclui a trituração ea dissociação do tecido em células individuais re,moval de contaminação com eritrócitos e fibroblastos, bem como de cultura primária e uma verificação fiável da origem das células de melanoma.
Relatórios recentes revelaram que melanomas, como a maioria dos tumores, porto uma pequena subpopulação de células-tronco cancerosas (CSCS), que parecem alimentar exclusivamente de iniciação e progressão tumoral em direção ao estado metastático. Um dos marcadores essenciais para a identificação e isolamento de CSC no melanoma é CD133. Para isolar CD133 + CSCs a partir de culturas primárias de melanoma, temos modificado e optimizado a separação de células magnético-Activated (MACS) procedimento de Miltenyi resultando em pureza elevada e classificação viabilidade de CD133 + CSCs e CD133 - a granel, que podem ser cultivados e analisados funcionalmente depois disso.
Introdução
Melanomas malignos cutâneos são o tipo menos comum, mas mais letal de câncer de pele. Devido a uma incidência crescente, um alto grau de malignidade e uma rápida disseminação, melanomas, hoje, representam 75% dos tumores malignos de pele relacionadas com 1,2 mortes. Além de excisão cirúrgica do tumor primário, quimioterapia, radioterapia, imunoterapia e quimioterapia combinada e imunoterapia de melanoma metastático são as estratégias de estado-da-arte para o tratamento de melanoma 3,4. No entanto, o melanoma maligno é caracterizado por uma má resposta à quimioterapia (5-12%) 5,6, e apenas os 50-70% dos pacientes com melanoma que carre....
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Protocolo
O esquema geral da experiência, incluindo a preparação de primários de um único células de tecido de tumor, a caracterização da cultura celular primária, a depleção de células de fibroblastos e de triagem magnética de CD133 CD133 + e - células de melanoma é mostrado na Figura 1.
1. Aquisição Amostra
- Verifique para aprovação ética antes de considerar os próximos passos.
- Prepare um tubo de 50 ml com PBS estéril suplementado com 1% de concentração de Penicilina Estreptomicina-de-final e entregar à cirurgia ou equipe.
- Organizar o transporte rápido de tecido de tumor a parti....
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Resultados
Preparação de células de um único tecido tumoral
A Figura 2 exemplifica uma ressecado metástase de nódulo linfático de um paciente de melanoma fase final antes (A) e depois (B) de dissociação mecânica em 2-4 pedaços mm. Seguindo dissociação enzimática do tecido e filtração através de uma malha de nylon de 70 um, as células foram sedimentadas e o sobrenadante foi descartado. Nesta etapa foi observada uma elevada contaminação com eritrócitos, como indicado pela cor avermelhada do.......
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Discussão
A fim de eliminar contaminações de eritrócitos do tumor pellet celular recomendamos usar o vermelho sangue solução de lise celular de Miltenyi. As vantagens de lisar os eritrócitos durante a centrifugação em gradiente de Ficoll tradicional densidade são que é mais rápida e mais simples. Além disso, as contaminações com Ficoll ou glóbulos vermelhos do sangue e da perda de células tumorais são evitados. Quando se observa o crescimento de fibroblastos em cultura primária de células que deve ser removido imediatamente, uma .......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Prof M. Dietel e Dirk Schumacher por apoiar este trabalho e leitura crítica do manuscrito.
A investigação conducente a estes resultados foi recebido apoios da Empresa Iniciativa sobre Medicamentos Inovadores comum ao abrigo do acordo de subvenção n ° 115234, os recursos de que são compostos de contribuição financeira do Programa da União Europeia Quadro (FP7/2007-2013) e empresas da EFPIA "em contribuição em espécie. Este trabalho também foi apoiado pelo Krebsgesellschaft Berliner (BKG).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagente | |||
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | |
| Solução de anfotericina B de 250 ug / mL em água desionizada | Sigma-Aldrich, Inc. | A2942-50ml | |
| anti-fibroblastos micropérolas | Miltenyi Biotec GmbH | 130-050-601 | |
| CD133 / 1 (W6B3C1) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-395 | |
| Colagenase IV | Sigma-Aldrich, Inc. | C5138 | |
| DNase I | APPLICHEM GmbH | A3778.0050 | |
| D-PBS sem Ca, Mg | PAA Laboratories GmbH | H15-002 | |
| Ácido etilenodiaminotetracético dissódico desidratado sal (EDTA) | Sigma-Aldrich, Inc. | E-7889 | |
| FBS Superior | Biochrom | S0615 | |
| Indireta CD133 humano Kit Micro-Bead | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-895 | Inclui: CD133 / 1 (AC133)-biotina, anti-biotina e micropérolas FcR reagente Blocking |
| Penicilina-Estreptomicina líquido, (100x) | Invitrogen GmbH | 15140-122 | |
| Quantum 263 | PAA Laboratories GmbH | U15-815 | |
| Red Blood Solução de Lise Celular (10x) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-094-183 | |
| Equipamento | |||
| Cell filtro (70 mm) | BD Biosciences | 352350 | |
| gentleMACS C Tubos | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-237 | |
| gentleMACS dissociador | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-235 | |
| MACS suporte multi Separador | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
| MACS Colunas separação 25 colunas LS | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-401 | |
| MACSmix Rotator Tubo | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | |
| Natriumchloride | Merck KGaA | 567.440-1KG | |
| Pré-separação Filtros | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | |
| Separador QuadroMACS | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-976 | |
| Rotilabo-seringa filtros (de 0,22, PES) | Carl Roth GmbH & Co. KG | P668.1 | |
| Steritop-GP Filtrar Unidade 500 ml | Miltenyi Biotec GmbH | SCGPS05RE |
Referências
- Garibyan, L., Fisher, D. E. How sunlight causes melanoma. Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).
- Radovic-Kovacevic, V., et al. Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma. Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).
- Lens, M. B., Eisen, T. G.
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Reimpressões e permissões
