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Artigo de método

Cultura de Células e Isolamento paciente Derivado de CD133

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DOI:

10.3791/50200

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13 de março de 2013

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1Institute of Pathology, Laboratory of Molecular Tumor Pathology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 2Institute for Chemistry and Biochemistry, Free University Berlin, 3Laboratory for Functional Genomics Charité (LFGC), Charité - Universitätsmedizin Berlin, 4Comprehensive Cancer Center Charité, Charité - Universitätsmedizin Berlin

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve a preparação do tecido acabado de melanoma obtidas em culturas primárias de células, e como para remover contaminações de eritrócitos e fibroblastos a partir de células tumorais. Finalmente, descrevemos como CD133 + De células estaminais putativas de melanoma são classificados do CD133 - Massa usando separação celular magnética activado (MACS).

Resumo

Apesar de melhores opções de tratamentos para o melanoma disponível hoje, os pacientes com melanoma maligno avançado ainda tem um prognóstico ruim de sobrevivência livre de progressão e global. Portanto, a pesquisa translacional precisa fornecer mais evidências molecular para melhorar terapias direcionadas para melanomas malignos. No passado, os mecanismos de oncogénicos relacionadas com melanoma foram extensivamente estudados em linhas celulares estabelecidas. No caminho para tratamentos mais personalizados baseados em perfis genéticos individuais, propomos usar linhas celulares derivadas paciente em vez de linhas celulares genéricos. Juntamente com os dados clínicos de alta qualidade, especialmente no acompanhamento do paciente, essas células serão fundamentais para compreender melhor os mecanismos moleculares por trás de progressão do melanoma.

Aqui, nós relatamos o estabelecimento de culturas primárias de melanoma tecido tumoral dissecados fresco. Este procedimento inclui a trituração ea dissociação do tecido em células individuais re,moval de contaminação com eritrócitos e fibroblastos, bem como de cultura primária e uma verificação fiável da origem das células de melanoma.

Relatórios recentes revelaram que melanomas, como a maioria dos tumores, porto uma pequena subpopulação de células-tronco cancerosas (CSCS), que parecem alimentar exclusivamente de iniciação e progressão tumoral em direção ao estado metastático. Um dos marcadores essenciais para a identificação e isolamento de CSC no melanoma é CD133. Para isolar CD133 + CSCs a partir de culturas primárias de melanoma, temos modificado e optimizado a separação de células magnético-Activated (MACS) procedimento de Miltenyi resultando em pureza elevada e classificação viabilidade de CD133 + CSCs e CD133 - a granel, que podem ser cultivados e analisados ​​funcionalmente depois disso.

Introdução

Melanomas malignos cutâneos são o tipo menos comum, mas mais letal de câncer de pele. Devido a uma incidência crescente, um alto grau de malignidade e uma rápida disseminação, melanomas, hoje, representam 75% dos tumores malignos de pele relacionadas com 1,2 mortes. Além de excisão cirúrgica do tumor primário, quimioterapia, radioterapia, imunoterapia e quimioterapia combinada e imunoterapia de melanoma metastático são as estratégias de estado-da-arte para o tratamento de melanoma 3,4. No entanto, o melanoma maligno é caracterizado por uma má resposta à quimioterapia (5-12%) 5,6, e apenas os 50-70% dos pacientes com melanoma que carregam o BRAF V600E benefício mutação genética do prometendo novas terapias-alvo como o tratamento com vemurafenib 7 Para melhorar a sobrevida global, uma melhor compreensão dos mecanismos de tumorigênese melanoma é necessário.

Para estudar estes mecanismos, no passado, comercialmente bem estabelecidacialmente disponíveis linhas celulares foram usados. Abordagens mais recentes para estudar os eventos moleculares de iniciação e progressão do câncer utilizam culturas primárias derivadas diretamente de tecido do tumor - uma estratégia benefícios múltiplos de rolamento: O pesquisador tem controle total do paciente e seleção de tecidos. As células da amostra obtida a partir habilmente seleccionados tecido do tumor, o tumor se assemelham com toda a sua heterogeneidade e dados de seguimento do paciente e uma patologia detalhadas estão disponíveis para permitir que as características da cultura a ser comparados com aqueles do tumor original 8.

Em contraste, a utilização de linhas celulares estabelecidas, como sistemas modelo relevantes na investigação do cancro é discutida de forma controversa. Já em 1987 Osborne e colegas descreveram significativas diferenças biológicas entre MCF-7 de mama humano linhas celulares de cancro de diferentes laboratórios 9. Esta instabilidade genómica e extensa variação na expressão de RNA durante a subcultura foi confirmed por Hiorns et al. e forneceram dados de apoio à evidência de que as linhas de células evoluem na cultura, enfraquecendo assim a relevância direta de tais culturas estabelecidas como modelos de câncer humano 10.

Outra consideração importante, que tem sido largamente ignorado ao longo dos anos, o risco de contaminação ou crescimento de culturas não relacionadas com as células "falsos", que foi pela primeira vez destacadas mais de vinte anos atrás, demonstrando que um grande número de linhas de células HeLa foram contaminadas pelos células 8,11. A má interpretação de dados de "falsos" linhas celulares recentemente veio à luz na literatura novamente. Usando uma combinação de perfis de ADN e citogenética molecular, MacLeod et ai. Revelou que de 252 novos derivadas de tumor de linhas de células humanas depositados na Colecção Alemã de Microorganismos e Culturas Celulares (DSMZ), cerca de 18% foram consideradas intra-espécies ou interespécies cruz -contaminantes 12,13.

Para evitar estes problemas e para fazer uso das vantagens acima mencionadas, decidimos estabelecer passagem baixa as linhas de células de melanoma a partir de metástases recentemente excisadas.

Tecnologias de células robustas de separação e análise exigem unicelulares preparações a serem gerados ao mesmo tempo, limitar a morte celular e a destruição das proteínas de superfície característicos. Um instrumento de bancada para a dissociação automatizado de tecidos em suspensões de célula única é o dissociador gentleMACS fabricado pela Miltenyi. Quando utilizado em combinação com tubos gentleMACS C e dissociação optimizado soluções, uma dissociação eficaz e suave do tecido do tumor, num sistema fechado é conseguido preservando epítopos de antigénios e reduzindo a perda de células. O instrumento dispõe optimizados, os programas pré-estabelecidos para uma variedade de aplicações específicas e garantias preparação padronizada de suspensões unicelulares a partir de tecido de melanoma 14.

Relatórios recentes revelaram que a maioria dos tumores de abrigar uma pequena subpopulação de células cancerosas chamados estaminais (CSCs), os quais apresentam exclusivamente tumor de iniciação e capacidade de auto-renovação. A identificação das células de melanócitos produtoras de tronco na derme da pele levou à hipótese de que estas células podem ser a origem das células de cancro da haste (CSCs) em melanoma vez que a exposição à radiação UVA podem preparar estas células para a transformação maligna 15. O resultado de tal lesão genética seriam as células que abrigam uma combinação de características de tumor e de células estaminais.

Um dos marcadores chave proposto para representar a subpopulação de CSCs em melanoma é CD133 16-20. CD133 (também conhecido como Prominin 1), um membro de glicoproteínas transmembranares pentaspan, é expresso em células progenitoras hematopoiéticas, células progenitoras endoteliais, células estaminais neuronais e gliais 21-23. A expressão de CD133 está correlacionada com adivisão celular assimétrica 24, e do epítopo glicosilada de CD133 mostrou ser downregulated upon a diferenciação das células 25. Recentemente, CD133 + de melanoma foram mostrados para ter auto-renovação e tumor de iniciação capacidade 19,20.

Para estudar a função das células CD133 + putativo melanoma CSCs, modificamos e otimizou a separação celular magnética Ativado (MACS), sistema de Miltenyi Biotech obter populações altamente enriquecido e viáveis ​​de CD133 + e CD133 - células.

Separação magnética de células grânulo-based permite para qualquer seleção negativa, como mostrado por Matheu et al. 26 ou seleção positiva como mostramos aqui. Durante a selecção positiva do tipo de célula alvo específico, por exemplo, as células que expressam CD133, é magneticamente marcadas com micro-esferas, partículas de 50 nm que são superparamagnéticas conjugados com anticorpos altamente específicos contra umo antigénio de superfície celular específico. Durante a separação, as células magneticamente marcadas são retidas no interior da coluna no campo magnético do separador, enquanto que as células não marcadas fluir. Seguindo os passos de lavagem, a coluna é removida do campo magnético do separador, e as células alvo são eluídos a partir da coluna. O LS ou colunas MS utilizada durante a sequência de selecção positiva em fracções de células marcadas e não marcadas com elevado grau de pureza. Por outro lado, as colunas de LD, usado para a selecção negativa, resultam em uma pureza ligeiramente inferior a fracção marcada. Devido à densa embalagem da sua matriz a taxa de fluxo nestas colunas é mais baixa resultante de um risco maior de células não marcadas para serem retidas na coluna. Colunas LD deve, portanto, ser utilizado apenas para a depleção rigoroso de uma subpopulação de células não desejados. Selecção positiva pode ser realizada por directa (anticorpo acoplado a microesferas) ou indirecta rotulagem magnética (incubação com microesferas após a incubation com o anticorpo primário). Microesferas MACS específicos estão disponíveis para a selecção positiva de numerosos tipos de células primárias de células de tumor da próstata, como melanoma ou 27.

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Protocolo

O esquema geral da experiência, incluindo a preparação de primários de um único células de tecido de tumor, a caracterização da cultura celular primária, a depleção de células de fibroblastos e de triagem magnética de CD133 CD133 + e - células de melanoma é mostrado na Figura 1.

1. Aquisição Amostra

  1. Verifique para aprovação ética antes de considerar os próximos passos.
  2. Prepare um tubo de 50 ml com PBS estéril suplementado com 1% de concentração de Penicilina Estreptomicina-de-final e entregar à cirurgia ou equipe.
  3. Organizar o transporte rápido de tecido de tumor a partir de cirurgia de laboratório de cultura de células a 4 ° C.

2. Preparando Melanoma primário individuais a partir de células de tecido de tumor

  1. Executar todas as etapas sob condições estéreis.
  2. Antes da ressecção do tumor, é necessário para preparar a mistura de dissociação. Mistura de 10 ml de dissociação por 2-4 g de tecido é necessária. A mistura pode ser usada immediadiatamente ou armazenada em alíquotas de 10 ml a -20 ° C para uso posterior.
    1. Prepara-se uma solução contendo cloreto de sódio 150 mM. Misturar utilizando um vortex até que a solução fique límpida. Se necessário estéril, solução de cloreto de sódio filtrado através de um filtro de 0,22 ^ m.
    2. Pesar DNase I e preparar uma solução contendo 10 mg / ml de DNase I em cloreto de sódio 150 mM. Misturar por inversão até a solução estar límpida.
    3. Prepara-se uma solução contendo 100mg/ml de colagenase IV em PBS. Misturar por inversão até a solução estar límpida. Alíquotas da solução de colagenase pode ser armazenada a -20 ° C durante vários meses.
    4. Preparar a mistura de dissociação com uma concentração final de 1% de Penicilina-Estreptomicina, 1 mg / ml de colagenase IV e 0,1 mg / ml de DNase I em Quantum médio 263. Misturar utilizando um vortex. Opcional: quando se utiliza tecido de melanoma derivada de pele add solução de anfotericina B na mistura de dissociação para uma concentração final de 1,5 ug / ml de anfotericina B.
  3. Pré-aquecer o reqquantidades uired mistura de dissociação, PBS e meio Quantum 263-37 ° C.
  4. Tecido local do tumor em uma placa de Petri esterilizada. Aspirar solução excessivo do tecido e adicionar 500 ul de mistura de dissociação. Picar tumor em pequenos pedaços de 2-4 mm utilizando frescos, bisturis esterilizados.
  5. Transferência de 2-4 g picada tecido do tumor em um tubo C gentleMACS contendo 5 ml de mistura de dissociação. Lavar placa de Petri com o adicional de 4,5 ml dissociação mistura e adicionar fragmentos de tecido restantes para a C Tube gentleMACS.
  6. Fechar gentleMACS tubo C e anexá-lo de cabeça para baixo na manga do dissociador gentleMACS. Execute o programa gentleMACS "h_tumor_01".
  7. Separe o gentleMACS tubo C do dissociador e incubar a amostra durante 30 min a 37 ° C sob rotação constante do tubo usando o Rotator MACSmix sobre a maior velocidade de execução (12 rpm), ou, rodando o tubo manualmente a cada 5 min para ressuspender os fragmentos de tecidos estabelecidas .
  8. Anexar gentleMACS tubo C de cabeça para baixo sobre a manga de tele gentleMACS dissociador e execute o programa gentleMACS "h_tumor_02".
  9. Separe o gentleMACS tubo C do dissociador e incubar a amostra durante 30 min a 37 ° C sob rotação constante do tubo usando o Rotator MACSmix sobre a maior velocidade de execução (12 rpm), ou, rodando o tubo manualmente a cada 5 min para ressuspender os fragmentos de tecidos estabelecidas .
  10. Anexar gentleMACS tubo C de cabeça para baixo sobre a manga da dissociador gentleMACS e execute o programa gentleMACS "h_tumor_03".
  11. Separe o gentleMACS tubo C do dissociador amostra, ressuspender e aplicar a suspensão de células para uma célula 70 um filtro colocado sobre um tubo de 50 ml. Se o entupimento do filtro de ocorrer, agitar a suspensão de células com uma ponta de filtro estéril até a suspensão completa percorreu.
  12. Lavar o filtro com 5 ml de células médio 263 Quantum.
  13. Opcional: se você ainda tem fragmentos de tecido deixado no filtro, fragmentos ressuspender em 263 Quantum médio e sementes-los de forma adequada cultura de células dish. Incubar fragmentos a 37 ° C e 5% CO 2.
  14. Descartar coador de células e fechar o tubo de 50 ml, com a suspensão de células digerido. Centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 300 xg e rejeitar o sobrenadante.
  15. Opcional: se a célula pellet aparece a vermelho, devido a uma grande quantidade de eritrócitos preparar 1x Red Blood Solução de Lise Celular por diluição 1:10 de solução 10x em água bidestilada, ressuspender sedimento de células em 500 ul de PBS e adicionam-se 5 ml de 1x lise de glóbulos vermelhos solução. Vortex 5 seg e incubar à temperatura ambiente durante 10 min. Centrifugar durante 5 minutos a 300 xg e rejeitar o sobrenadante.
  16. Ressuspender as células tumorais com Quantum 263 e semear as células em frasco de cultura de células apropriado. As células de tumor de cultura a 37 ° C e 5% de CO 2 e de células, rotineiramente passagem quando atingem confluência de 80%.

3. Caracterização da cultura primária de células de fibroblasto e Exaustão

  1. Analisar a cultura primária de células fenotipicamente utilizando uma microscopiape.
  2. Colher uma pequena quantidade (0,5 x 10 6 células) da cultura de células primária e realizar a RT-PCR com iniciadores para neoplásicas-,-melanoma, células-tronco e genes marcadores de células do estroma. Os genes mais importantes a analisar são CD90 (marcador de fibroblasto), TYR (melanoma / marcador de melanócitos), CD133 (cancro do marcador de células-tronco), CD83 (marcador de células dendríticas maduras) e um gene housekeeping (eg HPRT ou GAPDH).
  3. Se a análise microscópica e alta expressão de CD90 durante a RT-PCR revelou uma elevada contaminação da cultura melanoma primário com fibroblastos, você precisa esgotar fibroblastos utilizando as microesferas de Anti-fibroblastos e colunas D da Miltenyi.

4. Classificando celular magnético de CD133 + e CD133 - células de melanoma Usando Colunas LS

  1. Prepare MACS tampão contendo EDTA 2 mM e FCS a 5% em PBS. Mix por tampão invertendo e estéril-filtrado usando um 0,22 um Steritop-GP unidade de filtro. Frio buffer para 4-8 ° Ce desgaseificar antes da utilização.
  2. Pré-aquecer Accutase, PBS e Quantum meio 263-37 ° C.
  3. Lave 80% de células confluentes com PBS. Adicionar quantidade apropriada de Accutase e incubar as células até desprendimento da superfície da cultura. Recolher as células num tubo de 50 ml, utilizando meio de Quantum 263.
  4. Determinar o número de células e centrifugar a quantidade necessária de células (de acordo com o protocolo Miltenyi de um número máximo de 2x 10 9 células podem ser carregadas por coluna LS. Linha celular específicos números óptimos deverá ser determinado e pode ser consideravelmente mais baixa.) Durante 5 min a 300 xg e 4-8 ° C. Aspirar o sobrenadante completamente.
  5. Ressuspender um máximo de 1x 10 8 células com 350 tampão MACS ul (para números mais elevados de células escalar todos tampão MACS seguinte, FcR reagente de bloqueio, CD133/1-Biotin e anti-Biotina micropérolas volumes em conformidade).
  6. Adicionam-se 100 ul de reagente de bloqueio FcR.
  7. Adicionar 50 ul CD133/1-Biotin. Misturar bem utilizando um vortex e incubar a 4-8 ° C fou 10 min.
  8. Lave as células por adição de 10 ml de tampão de MACS e centrifugação durante 5 minutos a 300 xg e 4-8 ° C. Aspirar o sobrenadante completamente.
  9. Repita o passo de lavagem (4.8)
  10. Ressuspender o sedimento celular com 400 ul de tampão MACS.
  11. Adicionar 100 ul de anti-biotina micropérolas. Misturar bem utilizando um vortex e incubar a 4-8 ° C durante 15 min.
  12. Ao mesmo tempo, preparar o separador MACS para a separação magnética. Anexar QuadroMACS para MACS suporte Separador Multi. Inserir o número necessário de colunas LS com as asas da coluna para a frente no campo magnético do QuadroMACS. Colocar um filtro de pré-separação (com 30 mesh nylon mm) em cada coluna LS e de um tubo de recolha apropriado (15 ml ou 50 ml) debaixo de cada coluna. Prepare filtro e da coluna por lavagem com 3 ml de tampão MACS. Descarte fluxo através.
  13. Lave as células por adição de 10 ml de tampão de MACS e centrifugação durante 5 minutos a 300 xg e 4-8 ° C. Aspirar o sobrenadante completamente.
  14. Ressuspender as células com 500 uLMACS tampão e aplicar a suspensão de células na coluna LS com o filtro de pré-separação.
  15. Lavar três vezes com 3 ml de tampão por coluna MACS. Apenas adicionar novo buffer quando o reservatório coluna está vazio.
  16. O efluente coletado total contém o CD133 sem rótulo - fração celular.
  17. Jogue fora o filtro de pré-separação, remover a coluna do separador e colocá-lo em um tubo de coleta adequado.
  18. Aplicar 5 ml de tampão de MACS. Lave imediatamente as rotulados células CD133 + com firmeza empurrando o êmbolo para a coluna.
  19. Para aumentar a pureza da fracção negativa, aplicam-se a suspensão de células numa coluna LS novo equilibrada inserido no QuadroMACS. O efluente contém o CD133 - fracção.
  20. Descartar colunas.

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Resultados

Preparação de células de um único tecido tumoral

A Figura 2 exemplifica uma ressecado metástase de nódulo linfático de um paciente de melanoma fase final antes (A) e depois (B) de dissociação mecânica em 2-4 pedaços mm. Seguindo dissociação enzimática do tecido e filtração através de uma malha de nylon de 70 um, as células foram sedimentadas e o sobrenadante foi descartado. Nesta etapa foi observada uma elevada contaminação com eritrócitos, como indicado pela cor avermelhada do...

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Discussão

A fim de eliminar contaminações de eritrócitos do tumor pellet celular recomendamos usar o vermelho sangue solução de lise celular de Miltenyi. As vantagens de lisar os eritrócitos durante a centrifugação em gradiente de Ficoll tradicional densidade são que é mais rápida e mais simples. Além disso, as contaminações com Ficoll ou glóbulos vermelhos do sangue e da perda de células tumorais são evitados. Quando se observa o crescimento de fibroblastos em cultura primária de células que deve ser removido imediatamente, uma ...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Prof M. Dietel e Dirk Schumacher por apoiar este trabalho e leitura crítica do manuscrito.

A investigação conducente a estes resultados foi recebido apoios da Empresa Iniciativa sobre Medicamentos Inovadores comum ao abrigo do acordo de subvenção n ° 115234, os recursos de que são compostos de contribuição financeira do Programa da União Europeia Quadro (FP7/2007-2013) e empresas da EFPIA "em contribuição em espécie. Este trabalho também foi apoiado pelo Krebsgesellschaft Berliner (BKG).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagente
Accutase PAA Laboratories GmbH L11-007
Solução de anfotericina B de 250 ug / mL em água desionizada Sigma-Aldrich, Inc. A2942-50ml
anti-fibroblastos micropérolas Miltenyi Biotec GmbH 130-050-601
CD133 / 1 (W6B3C1) Miltenyi Biotec GmbH 130-092-395
Colagenase IV Sigma-Aldrich, Inc. C5138
DNase I APPLICHEM GmbH A3778.0050
D-PBS sem Ca, Mg PAA Laboratories GmbH H15-002
Ácido etilenodiaminotetracético dissódico desidratado sal (EDTA) Sigma-Aldrich, Inc. E-7889
FBS Superior Biochrom S0615
Indireta CD133 humano Kit Micro-Bead Miltenyi Biotec GmbH 130-091-895 Inclui: CD133 / 1 (AC133)-biotina, anti-biotina e micropérolas FcR reagente Blocking
Penicilina-Estreptomicina líquido, (100x) Invitrogen GmbH 15140-122
Quantum 263 PAA Laboratories GmbH U15-815
Red Blood Solução de Lise Celular (10x) Miltenyi Biotec GmbH 130-094-183
Equipamento
Cell filtro (70 mm) BD Biosciences 352350
gentleMACS C Tubos Miltenyi Biotec GmbH 130-093-237
gentleMACS dissociador Miltenyi Biotec GmbH 130-093-235
MACS suporte multi Separador Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS Colunas separação 25 colunas LS Miltenyi Biotec GmbH 130-042-401
MACSmix Rotator Tubo Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753
Natriumchloride Merck KGaA 567.440-1KG
Pré-separação Filtros Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407
Separador QuadroMACS Miltenyi Biotec GmbH 130-090-976
Rotilabo-seringa filtros (de 0,22, PES) Carl Roth GmbH & Co. KG P668.1
Steritop-GP Filtrar Unidade 500 ml Miltenyi Biotec GmbH SCGPS05RE

Referências

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Reimpressões e permissões

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