Mitocôndrias associadas Membranas ER (MAMs) e glicoesfingolipídeos microdomínios enriquecidos (GEMS): Isolamento de cérebro de rato

Resumo

Este procedimento ilustra como isolar a partir do cérebro do rato adulto membranas mitocôndrias associadas ER ou mams e as fracções enriquecidas glicoesfingolipídeos-microdomínio de MAMs e preparações mitocondriais.

Resumo

Organelas intracelulares são estruturas altamente dinâmicas com diferentes forma e composição, que estão sujeitos a células específicas sinais intrínsecos e extrínsecos. As membranas são freqüentemente justapostas em locais de contato definidas, que se tornam centros de troca de moléculas de sinalização e componentes de membrana ^1,2,3,4. As inter-organellar microdomínios de membrana que são formados entre o retículo endoplasmático (ER) e das mitocôndrias durante a abertura do IP3-sensitive Ca ^{2 +} canal são conhecidos como as mitocôndrias associado-ER membranas ou mams ^4,5,6. A composição de proteína / lípido e propriedades bioquímicas dos sítios de contacto de membrana têm sido extensivamente estudadas em particular em relação ao seu papel na regulação da Ca ^{2 +} intracelular ^4,5,6. O ER serve como o armazenamento primário do Ca ^{2 +} intracelular, e, nessa qualidade regula uma variedade de processos celulares a jusante de sinalização de Ca ^{2 +,} including pós-traducional de dobragem de proteína e proteína maturation7. As mitocôndrias, por outro lado, manter a homeostase ^de Ca2 ^+, por tamponação citosólica ^{concentração} de Ca2 ⁺ que impede a abertura de vias apoptóticas jusante de Ca ^{2 + 4,8} desequilíbrio. A natureza dinâmica das MAMs torna locais ideais para dissecar mecanismos básicos celulares, incluindo Ca ^{2 +} de sinalização e regulação da mitocondrial Ca ^{2 +} sobrevivência concentração biossíntese de lipídios e transporte, metabolismo energético celular e ^{4,9,10,11,12.} Vários protocolos têm sido descritas para a purificação dessas microdomínios de tecido do fígado e células de cultura ^13,14.

Tomando métodos anteriormente publicados em consideração, nós adaptamos um protocolo para o isolamento de mitocôndrias e MAMs a partir do cérebro de rato adulto. Para este procedimento, nós adicionamos uma etapa de purificação extra, ou seja, uma extração de Triton X100, que enables o isolamento da fracção microdomínio enriquecido glicosfingolípidos (GEM) dos MAMs. Estas preparações GEM partes componentes de proteínas com várias cavéolas e lipídico jangadas, derivadas a partir da membrana plasmática ou outras membranas intracelulares, e são propostos para funcionar como pontos de recolha para a agregação de proteínas receptoras e de interacções proteína-proteína ^4,15.

Protocolo

O protocolo que se segue destina-se ao isolamento e purificação de MAMs e gemas de cérebro de rato

Soluções necessárias para o isolamento de mitocôndrias, MAMs e pedras preciosas

O fracionamento de obter preparação mitocondrial crua:

Solução A: 0,32 M de sacarose, 1 mM de NaHCO _3, 1 mM _de MgCl2, 0,5 mM de CaCl ₂ + inibidores de protease (adicionar fresco, conforme necessário)

Solução B: 0,32 M de sacarose, 1 mM de NaHCO ₃ Inibidores da Protease + (adicionar fresco, conforme....

Resultados

Com base em nossa experiência com o uso deste protocolo podemos seguramente recomendar para o isolamento e purificação de MAMs, Gemas e frações mitocondriais de cérebro de rato. O processo como descrito é altamente reprodutível e consistente. Na Figura 1 mostra uma imagem representativa da camada de forma pura e mitocôndrias MAMs em um gradiente de Percoll (passo 3.4). Uma banda, definida leitoso contendo purificado mitocôndrias (Mito-P) segrega na parte inferior do tubo de ultracentrífuga, enquanto que.......

Discussão

Os locais de contacto entre as membranas intracelulares ou entre organelas e da membrana plasmática de células representam dinâmicas plataformas de sinalização para os processos celulares básicos. A caracterização exata de sua função e composição em ambas as condições fisiológicas e patológicas requer protocolos de purificação confiáveis ​​e reprodutíveis. Os métodos descritos aqui foram especificamente optimizados pelo nosso laboratório para o isolamento e purificação dos MAMs e as suas gemas correspondentes a partir d.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente / Material	Companhia	Número de Catálogo	Comentários
			REAGENTES
			Fracionamento
Sacarose	Fisher Scientific	S5-500
Bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich	S-5761
Cloreto de magnésio, hexa-hidratada	Fisher Scientific	BP214-500
O cloreto de cálcio hidratado,	Sigma-Aldrich	C-5080
			MAM
D-Manitol	Sigma-Aldrich	M9546-250G
Hepes	Fisher Scientific	BP310-500
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378-250G
BSA, Fracção V, de choque de calor, liofilizado	Roche	03-116-964-001
Percoll	GE	17-0891-02
			GEM
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500 ml
Cloreto de Sódio	Fisher Scientific	S271-3
Tris Base	Roche	03-118-142-001
HCl	Fisher Scientific	A144S-500
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
Dodecil sulfato de sódio (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500
			Comum
Inibidores de protease Tablets, completa EDTA-livres	Roche	11-873-580-001
			EQUIPAMENTOS
2 ml Douce todo em vidro Grinders Tecido	Kimble perseguição	885300-0002
15 ml de polipropileno cónicas Tubos Centrífuga, BD Falcon	BD	352097
30 ml de fundo redondo tubos de centrífuga de vidro	Kimble perseguição	45500-30
15 ml de fundo redondo de vidro CentriTubos Fuge	Kimble perseguição	45500-15
Tubos de ultracentrifugação, ultra-claro, Thinwall, mm 14x89	Beckman-Coulter	344059
Parafilm	Cole-Parmer	PM996
Descartável vidro borosilicato Pasteur Pipetas, 9 "	Fisher Scientific	13-678 20C-