Rápidas de teste colorimétrico para Qualitativamente Distinguir RNA e DNA em amostras biomoleculares

Resumo

Um conjunto de ensaios colorimétricos é descrito para a proteína rapidamente distinguir, RNA, DNA, e re-dução de açúcares em amostras biomoleculares potencialmente heterogéneos.

Resumo

Experimentação Biochemical geralmente requer o conhecimento preciso, numa fase precoce, do ácido nucleico, proteínas, e outros componentes biomoleculares em espécimes potencialmente heterogéneos. Os ácidos nucleicos podem ser detectados através de várias abordagens estabelecidas, incluindo os métodos analíticos que são espectrofotométrica (por exemplo, A _260), fluorométrico (por exemplo, a ligação de corantes fluorescentes), ou colorimétrico (nucleósidos específicos de reacções químicas cromogénicos). ¹ Ainda que não se pode distinguir facilmente RNA a partir de DNA, a A ₂₆₀ / A ₂₈₀ rácio é geralmente utilizado, uma vez que proporciona um método simples e rápido ² Avaliação do teor relativo de ácido nucleico, que absorve predominantemente próximo de 260 nm e proteína, o qual absorve principalmente próximo de 280 nm. Coeficientes <0,8 são considerados como indicativos de "puras" amostras de proteína, enquanto que o ácido nucleico puro (NA) é caracterizada por taxas de> 1,5 ^3.

HoWever, há situações em que o conteúdo de proteína / NA não pode ser tão claramente ou de forma confiável inferida a partir de simples uv-vis medições espectrofotométricas. Por exemplo, (i) As amostras podem conter uma ou mais proteínas que são relativamente desprovida dos aminoácidos aromáticos responsáveis ​​pela absorção a 280 nm (≈ Trp, Tyr, Phe), como é o caso com algumas pequenas proteínas de ligação ao RNA e (ii) as amostras podem exibir intermédios A ₂₆₀ / A ₂₈₀ ratios (~ 0,8 <~ 1.5), onde o teor de proteínas / NA é muito menos clara e pode mesmo reflectir alguma afinidade elevada associação entre a proteína e os componentes de NA. Para tais situações, descrevemos aqui um conjunto de ensaios colorimétricos para distinguir rapidamente RNA, DNA e açúcares redutores, em uma amostra potencialmente misto de biomoléculas. Os métodos baseiam-se na sensibilidade diferencial de pentoses e outros hidratos de carbono para a Benedict, Bial (orcinol), e (difenilamina) Dische de reagentes, os protocolos podem ser simplificados comconcluída em questão de minutos, sem quaisquer passos adicionais de ter de isolar os componentes. Os ensaios podem ser realizados em paralelo, para diferenciar entre o RNA e de DNA, bem como indicar a presença de açúcares redutores livres tais como a glicose, frutose, ribose e (Figura 1).

Introdução

Grande parte da biologia das células ocorre através de interacções moleculares envolvendo DNA e RNA. ⁴ Estes ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente (AN) interagem uns com os outros, ^{5, 6,} com as proteínas e com uma série de compostos de moléculas pequenas e ligandos in vivo (por exemplo, catiões divalentes ^7). As interacções podem ser de curta ou de longa duração (cineticamente), pode variar desde moderada a alta para baixa afinidade (força termodinâmica), e também podem apresentar uma variação substancial nas propriedades químicas e especificidade - algumas associações são bastante específicas (por e....

Protocolo

1. Ensaio de Bento XVI para a Redução Açúcares

1. Prepara-se uma quantidade adequada de reagente de Benedict - 940 mM de carbonato de sódio anidro, 588 mM de citrato de sódio desidratado, 68 mM de cobre penta-hidratado (II). Este reagente pode ser armazenada à temperatura ambiente (RT) durante pelo menos seis meses sem qualquer mudança notável na reactividade.
2. O reagente acima é 6x. Assim, para 600 ul de reacções, adicionar 100 ul de reagente de Benedict para um tubo limpo de microcentrífuga de 1,5 ml (por exemplo, Eppendorf marca), por amostra a ser testada.
3. Adicionar em qualquer lugar a partir de 10 ul a 500 ul de amostra a este....

Resultados

Os resultados são mostrados na Figura 3 para a aplicação destes ensaios colorimétricos para os compostos de referência conhecidos. Representativos dos dados qualitativos são mostradas para (a) a Benedict, Bial de orcinol (b), e Dische de difenilamina (c) ensaios, e as curvas-padrão para estes três ensaios estão apresentados na Figura 4. Em painéis 3 (ac), os painéis da esquerda mostram as experiências positivas / negativas de controlo utilizando analitos adequadamente reactivos / não re.......

Discussão

Os ensaios colorimétricos aqui apresentados oferecem uma abordagem simples para avaliar rapidamente a natureza química das misturas biomoleculares, tais como os que são encontrados quando a purificação de proteínas, RNAs ou complexos de lisado de células inteiras, em preparação para estudos posteriores. Como biologia estrutural prossegue montagens mais semelhante à nativa, desafios progressivamente maiores, tais como a heterogeneidade da amostra, serão colocados pelos complexos intrincados e multi-componente. Mont.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente ou equipamento	Fornecedor / empresa	Número de catálogo	Comentários, notas
Carbonato de sódio anidro	Fisher Scientific	S263
Di-hidrato de citrato de sódio	Sigma	S-4641
De cobre penta-hidratado (II)	VWR	VW3312-2
Monohidratada orcinol	Sigma-Aldrich	O1875
HCl concentrado	VWR	BDH3030
Hexa-hidrato de cloreto férrico	Sigma	F-2877
Difenilamina	Aldrich	112763
Ácido acético glacial	Fisher Scientific	A28
Ácido sulfúrico	Sigma-Aldrich	258105
Etanol	Koptec	V1101
Ribose	Sigma	R-7500	prep a 1% w / v de H 2 O
Ácido ribonucleico de fermento de padeiro (S. cerevisiae)	Sigma	R6750	prep a 10 mg / ml em H 2 O; armazenar a -20 ° C
Ácido desoxirribonucleico (sal de sódio), a partir de timo de vitelo	Sigma	D1501	prep a 10 mg / ml em H 2 O; armazenar a 4 ° C
			Reagentes, Equipamentos e Segurança Materiais estão listados na following tabela na ordem em que aparecem na secção de protocolo. Salvo indicação em contrário (acima), todos os reagentes podem ser armazenados à temperatura ambiente e iluminação. Para todos os itens não listados a seguir (por exemplo, tubos de microcentrífuga), a marca usual / modelo / variedade encontrada num laboratório padrão bioquímica pode ser utilizada (por exemplo, Eppendorf marca tubos de 1,5 ml de microcentrífuga). Padrão tubos de microcentrífuga de plástico deve ser usado para as etapas que envolvem centrifugação (por exemplo, para material de sedimento de partículas próximo da extremidade de cada protocolo). Nenhum material em particular é preferível, desde que os tubos podem ser selados, os tubos de polipropileno típicos encontrados em laboratórios de bioquímica funcionar bem. Em termos de preocupações de segurança e eliminação de resíduos, precauções padrão de laboratório (óculos de segurança, exaustores) deve ser exercida em pré-apara, trabalhando com, e descarte de soluções contendo acético concentrado, ácido clorídrico, ou ácido sulfúrico. Para reagentes orgânicos, tais como orcinol ou diphenilamina, luvas de borracha nitrílica são preferíveis ao látex comum (borracha natural) variedade.