Rápidas de teste colorimétrico para Qualitativamente Distinguir RNA e DNA em amostras biomoleculares

Grande parte da biologia das células ocorre através de interacções moleculares envolvendo DNA e RNA. ⁴ Estes ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente (AN) interagem uns com os outros, ^{5, 6,} com as proteínas e com uma série de compostos de moléculas pequenas e ligandos in vivo (por exemplo, catiões divalentes ^7). As interacções podem ser de curta ou de longa duração (cineticamente), pode variar desde moderada a alta para baixa afinidade (força termodinâmica), e também podem apresentar uma variação substancial nas propriedades químicas e especificidade - algumas associações são bastante específicas (por exemplo, DNA · · · fatores de transcrição, RNA · · · fatores de splicing), enquanto outras interações são necessariamente muito mais genérico (por exemplo, o DNA · · · bacterianas proteínas de histona-like HU ^8). Não-específicas interações com AN pode ter consequências práticas para experimentos in vitro envolvendo misturas de biomolecules, uma vez que é possível, e mesmo provável, que alguns AEs vai associar com as biomoléculas de interesse, pelo menos em alguns subconjuntos de condições experimentais que está sendo usado (a força iónica, o pH da solução, etc.)

Considere-se, por exemplo, a produção de uma proteína de interesse (POI), através de sobre-expressão heteróloga da proteína recombinante em Escherichia coli da cultura de células; tal procedimento é realizado rotineiramente em virtualmente qualquer laboratório de biologia estrutural ⁹ Na preparação para experiências adicionais, tais. como caracterização bioquímica / biofísica, cristalização, etc., os esforços iniciais geralmente o foco sobre a obtenção de uma quantidade suficiente do PI em como uma forma pura quanto possível, de preferência como um espécime quimicamente homogéneo e biofísico monodisperso. Após a ruptura das células hospedeiras, os estágios iniciais de um fluxo de trabalho de purificação típico visam isolar o POI de E. proteínas de E. coli, ácidos nucleicos, fragmentos de paredes de células,e outros componentes do lisado celular. No entanto, o anfitrião AN pode co-purificar com o POI por várias razões fisico-químicas - um POI altamente básica pode não especificamente hospedeiro suspenso DNA / RNA, o POI pode ter uma actividade de ligação genérico NA (por exemplo, o HU acima mencionado); o POI pode ser um bastante específico proteína NA-ligação, mas exibem reactividade cruzada com RNAs hospedeiras ou DNAs; hospedeiro AN pode interagir com uma matriz de cromatografia e, assim, apenas co-eluir com o POI, e assim por diante. Indiscriminada, de alta afinidade de ligação do anfitrião AN a um PI pode representar um sério problema, porque as impurezas NA provavelmente vai interferir com os experimentos a jusante (por exemplo, ensaios de anisotropia de fluorescência de POI • RNA vinculativo ^10). Alternativamente, POI imprevisto · · · NA associações também podem ser vistos por acaso, como tais interações iluminar a capacidade do POI de ligação de ácidos nucleicos. De qualquer maneira, se AN são componentes-chave ou contaminantes, deve-se primeiro quantificar eidentificar o tipo (DNA, RNA) de co-purificação AN em preparação para ensaios a jusante.

Diversos métodos analíticos para a detecção de existir e quantificando AN numa amostra. A maior parte dos métodos disponíveis são fundamentalmente ou espectrofotométrica (por exemplo, um ₂₆₀ valores de absorvância e A ₂₆₀ / A ₂₈₀ rácios), fluorométrico (por exemplo, a ligação do tiazole de laranja ou de outros corantes fluorescentes para NA), ou colorimétrico (susceptibilidade de nucleósidos para as reacções químicas cromóforos que rendimento de absorção na região do UV-Vis do espectro electromagnético), tal como foi recentemente descrito por De Mey et al. ^{1 No} entanto, o passo crucial de identificar o tipo de polinucleótido como RNA ou DNA está para além do alcance de muitos destes quantificação abordagens. Aqui nós fornecemos um conjunto de ensaios colorimétricos para rapidamente identificar os tipos de componentes de NA em uma amostra protéica.

Os protocolos aqui descritos cum ser eficientemente executados sem passos adicionais de isolar as impurezas potenciais de NA, e dependem do ensaio de Benedict para açúcares redutores ^11, o ensaio de orcinol para pentoses ^{12,13, 14,15} e reacções difenilamina de 2'-deoxypentoses (Figuras 1 e 2) . O teste de Benedict (Figura 2a) utiliza a capacidade da forma linear, de cadeia aberta (aldeído) com um açúcar aldose para reduzir Cu ^{2 +,} com a oxidação concomitante de carbonilo do açúcar a uma porção de carboxilato de metilo e de produção de Cu ₂ O como um precipitado vermelho insolúvel. Esta reacção irá testar positivo com livre açúcares redutores tais como aldoses e cetoses (que converter as aldoses correspondentes, através de intermediários enediol), mas não com os açúcares pentose que estão bloqueados em forma cíclica, como parte do esqueleto covalente de um DNA ou RNA de polinucleótido. Devido à exigência de um minimalista funcionalidade hemiacetal livre, co outrompounds que poderia teste positivo neste ensaio - e, portanto, actuar como potenciais interferentes - incluem α-hidroxi-cetonas e oligossacarídeos curtos (por exemplo, a maltose dissacarídeo). Tanto do Bial orcinol (Figura 2b) e difenilamina Dische (Figura 2c), as reacções são baseados em destruição inicial da espinha dorsal de polinucleótidos, por despurinação do nucleósido e ácido-ou ainda catalisada por base a hidrólise dos nucleótidos mãe, para se obter furan-2 -carbaldeído (furfural) derivados; estes derivados reagem então com um fenol ou poli-hidroxi tais como orcinol (Bial) ou difenilamina (Dische de) os reagentes para formar produtos de condensação cor de estrutura química em grande parte desconhecida. O DNA versus ARN especificidade do ensaio do Dische decorre do facto de o açúcar pentose deve ser 2'-desoxigenada, a fim de ser susceptível à oxidação a ω-hydroxylevulinyl aldeído, o qual reage posteriormente com difenilaminasob condições ácidas, para se obter um condensado de azul brilhante (Figura 2c). Utilizando os protocolos descritos aqui simplificadas, verificou-se que estas reacções colorimétricas açúcar específicos podem diferenciar entre ARN e ADN, e também irá indicar a presença de açúcares redutores livres tais como a glicose, frutose, ribose, ou numa amostra biomolecular.

1. Ensaio de Bento XVI para a Redução Açúcares

1. Prepara-se uma quantidade adequada de reagente de Benedict - 940 mM de carbonato de sódio anidro, 588 mM de citrato de sódio desidratado, 68 mM de cobre penta-hidratado (II). Este reagente pode ser armazenada à temperatura ambiente (RT) durante pelo menos seis meses sem qualquer mudança notável na reactividade.
2. O reagente acima é 6x. Assim, para 600 ul de reacções, adicionar 100 ul de reagente de Benedict para um tubo limpo de microcentrífuga de 1,5 ml (por exemplo, Eppendorf marca), por amostra a ser testada.
3. Adicionar em qualquer lugar a partir de 10 ul a 500 ul de amostra a este tubo, o volume óptimo pode ser determinado com base na intensidade de formação de cor num ensaio de funcionamento inicial. Se a amostra suficiente estiver disponível, então começar tais ensaios no volume de amostra máximo possível (isto é, cinco sextos do volume de reacção total, 500 ul de amostra, neste caso), e depois dilui-se em ensaios subsequentes.
4. Adicionar DDH ₂ O para o tuser para trazer o volume final de 600 ul; misturar a solução por agitação em vórtex ou pipetagem.
5. Incubar as amostras durante 20 minutos num banho de água a ferver.
6. Retirar a amostra do banho de aquecimento e permita que arrefeça à temperatura ambiente durante 10 min.
7. Centrifugar o tubo de amostra a> 9300 x g (~ 10.000 rpm em um FA45-24-11 Eppendorf rotor de ângulo fixo) durante 5 min, de modo a sedimentar as partículas de matéria, este passo é mais importante para estudos quantitativos e não qualitativos.
8. Alíquota do sobrenadante deste tubo numa cuvete limpa.
9. Em branco o espectrofotômetro UV-Vis com água.
10. Medir a absorvância da amostra a 475 nm.

2. Ensaio orcinol Bial para Pentoses Açúcares

1. Prepara-se uma quantidade apropriada de reagente fresco de Bial - 24,2 mono-hidrato de orcinol mM (ver Figura 2b para a estrutura deste composto), HCl 6 M, 0,025% w / v de cloreto férrico hexahidratado Nota.:Para um armazenamento prolongado, reagente a Bial pode ser preparado como duas soluções de reserva separadas: (i) um reagente de [0,05% w / v FeCl3 • 6H ₂ O em HCl concentrado] e (ii) mono-hidrato de Reagente B mM [422 orcinol preparado em 95 % de etanol]. Um reagente pode ser armazenada à temperatura ambiente durante seis meses; Reagente B podem ser armazenadas a 4 ° C durante um mês, coberta com papel de alumínio para limitar a exposição à luz. Estas soluções stock são misturados a 15 (A): 1 (B) proporção v / v antes de usar.
2. O reagente acima é 2x. Assim, para as reacções 1,0 ml, adicionar 500 ul de reagente Bial para um tubo limpo de microcentrífuga de 1,5 ml, por amostra a ser ensaiada.
3. Adicionar em qualquer lugar a partir de 10 ul a 500 ul de amostra a este tubo. Conforme nota 1.3 (acima), se amostra suficiente estiver disponível, então começar reacções de ensaio utilizando o volume de amostra máximo possível (isto é, a metade do volume total de reacção de 500 ul de amostra, neste caso) e dilui-se a partir daí.
4. Adicionar DDQ ₂ O para o tubo para levar a final de volume de 1,0 ml; misturar a solução por agitação em vórtex ou pipetagem.
5. Incubar as amostras durante 20 minutos num banho de água a ferver.
6. Retirar a amostra do banho de aquecimento e permita que arrefeça à temperatura ambiente durante 10 min.
7. Centrifugar o tubo de amostra a> 9300 x g (~ 10.000 rpm em um FA45-24-11 Eppendorf rotor de ângulo fixo) durante 5 min, de modo a sedimentar as partículas de matéria, este passo é mais importante para estudos quantitativos e não qualitativos.
8. Alíquota do sobrenadante deste tubo numa cuvete limpa para inspecção visual.
9. Para a análise semi-quantitativa, o ensaio em branco espectrofotómetro uv-vis com água e medir a absorvância da amostra a 660 nm cuvete.

3. Ensaio Dische de difenilamina para 2'-deoxypentose Sugars

1. Prepara-se uma quantidade adequada de reagente de difenilamina Dische - 60 mM difenilamina, 11 M de ácido acético glacial, 179 mM de ácido sulfúrico, 62% v / v de etanol. Este reagente pode ser previamentepared antecipadamente e guardado à temperatura ambiente num recipiente escuro, ou coberto com a folha, para limitar a exposição à luz. Devido à sensibilidade à luz o reagente não deve ser armazenado indefinidamente, embora, na prática, podem ser preparados a cada dois a três meses, sem qualquer alteração aparente na reactividade.
2. O reagente acima é 2x. Assim, para as reacções 1,0 ml, adicionar 500 ul de reagente de Dische para um tubo limpo de microcentrífuga de 1,5 ml, por amostra a ser ensaiada.
3. Adicionar em qualquer lugar a partir de 10 ul a 500 ul de amostra a este tubo. Conforme nota 1.3 (acima), se amostra suficiente estiver disponível, então começar reacções de ensaio utilizando o volume de amostra máximo possível (isto é, a metade do volume total de reacção de 500 ul de amostra, neste caso) e dilui-se a partir daí.
4. Adicionar DDQ ₂ O para o tubo para perfazer o volume final para 1,0 ml; misturar a solução por agitação em vórtex ou pipetagem.
5. Incubar as amostras durante 20 minutos num banho de água a ferver.
6. Retirar a amostra do banho de aquecimento e alow-a arrefecer à temperatura ambiente durante 10 min.
7. Centrifugar o tubo de amostra a> 9300 x g (~ 10.000 rpm em um FA45-24-11 Eppendorf rotor de ângulo fixo) durante 5 min, de modo a sedimentar as partículas de matéria, este passo é mais importante para estudos quantitativos e não qualitativos.
8. Alíquota do sobrenadante deste tubo numa cuvete limpa para inspecção visual.
9. Para a análise semi-quantitativa, o ensaio em branco espectrofotómetro uv-vis com água e medir a absorvância da amostra a 600 nm cuvete.

4. Outras Notas de uso

1. As seguintes classes de moléculas são compostos de referência apropriados para reacções de controlo positivo e negativo para cada ensaio:
   • Benedict - positivo = livre ribose, frutose, glicose; negativa = RNA, DNA, ATP, etc. (Qualquer sacárido falta uma funcionalidade sem açúcar redutor)
   • Bial - positivo = RNA (por exemplo, extrato de levedura de padeiro), ribose, ATP, UMP, negativo = bovina Serhum albumina (BSA) ou qualquer outra proteína
   • Dische de - positivo = DNA (por exemplo, timo de vitela); negativa = RNA, ATP, etc. (Qualquer nucleotídeo não-2'-desoxigenado)
2. Estes ensaios foram encontrados para ser bastante resistentes a compostos frequentemente utilizados na purificação de proteínas, por exemplo, os sais comuns, tais como NaCl, (NH _{4) 2} SO _4, e K ₂ SO ₄ não interferiu, e as reacções aparecem geralmente afectada pela o conteúdo do diluente. Detergentes ou agentes caotrópicos, tais como ureia podem afectar a reactividade dos ensaios, se o pH é altamente básico, um neutro a gama de pH ácida é geralmente mais óptimo para a de Bial e ensaios Dische, porque a química de reacção subjacente (ver o texto e os protões na Figura 2b, c). Potencialmente subótimas condições de reação, interferentes suspeitos, etc. devem ser testadas numa base de caso-a-caso, utilizando-se o controlo positivo e negativo experimentos wom os compostos de referência.

Os resultados são mostrados na Figura 3 para a aplicação destes ensaios colorimétricos para os compostos de referência conhecidos. Representativos dos dados qualitativos são mostradas para (a) a Benedict, Bial de orcinol (b), e Dische de difenilamina (c) ensaios, e as curvas-padrão para estes três ensaios estão apresentados na Figura 4. Em painéis 3 (ac), os painéis da esquerda mostram as experiências positivas / negativas de controlo utilizando analitos adequadamente reactivos / não reactivo, estes resultados visuais são mostradas no local, nas cuvettes como descrito em Protocols 1-3 (acima). O direito sub-painéis mostram uma série de titulação para cada analito em questão. No ensaio a Benedict (a), o controlo positivo é a ribose (0,42 mg / ml), enquanto que os controlos negativos são a água, uma proteína genérico (0,75 mg / ml de BSA), e dois não-redutores (DNA de 0,75 mg / ml e RNA de 12,5 mg / ml). No ensaio de orcinol (b), os controlos positivos são ribose (0,15 mg / ml), de ARN (7,5 mg / ml), e DNA (0,45 mg / ml), enquanto que a água e BSA proteína (0,45 mg / ml) são controlos negativos. No ensaio de difenilamina (c), ADN de timo de vitelo (0,45 mg / ml) é apresentado como um controlo positivo, e água, levedura, extracto de RNA (7,5 mg / ml), ribose (0,15 mg / ml) e BSA (0,45 mg / ml), servem como controlos negativos. Finalmente, o painel (d) ilustra a robustez dos ensaios, mostrando a reacção de Dische com amostras de diferentes heterogeneidade: duas concentrações de ADN são apresentados como um controlo positivo nas duas amostras para a esquerda (cuvettes 1-2), DNA + RNA misturas ( em várias proporções) são mostrados nos próximos três amostras (3-5), e os últimos três amostras mostram ADN na ausência (amostra 6) ou presença (amostras 7-8) do ácido nucleico da proteína de ligação 'HFQ'. 16 Note-se que o resultado positivo do ensaio a Dische é preservada por DNA contendo as amostras, mesmo na presença de "contaminantes" RNA ou proteínas.

Análise quantitativa: As gamas de diluição na Figura 3 (ac) Os painéis variar porque cadareacção tem um limite de detecção visual distinta, dependendo do tipo de açúcar a ser ensaiada. Espectrofotométrica, em vez de visual, de detecção pode ser utilizada para melhorar os intervalos de medição, por exemplo, como mostrado na Figura 4, para o (a) de Benedict, (b) Bial, e (c) Dische de ensaios. Embora os protocolos descritos aqui destinam-se principalmente como ensaios qualitativos, a relação de Beer-Lambert entre absorvância e concentração permite, pelo menos, semi-estimativa quantitativa do teor de açúcar ou de ácido nucleico. Como um exemplo de uma curva padrão para calibração do teste a Benedict, um ajuste de regressão linear de absorvância (475 nm) em função da concentração da ribose é mostrado na Figura 4 (a); barras de erro indicam o desvio padrão de N = 3 repetições, sendo o coeficiente de correlação ao quadrado é fornecido. O desvio da linearidade em concentrações muito baixas de ribose (por exemplo, o ponto de referência mM 0,28) reflecte a sensibilidade limitada do ensaio. Embora o quantodiz são indicadas principalmente para estudos qualitativos, as seguintes orientações são sugeridos para análise semi-quantitativa:

• Para o ensaio de Benedict (Figura 4a): A leitura da reacção (A 475 nm) foi encontrado para ser linear, pelo menos, ao longo da gama 0,04 → 0,5 mg / ml de analito, tal como efectuado em triplicado.
• Para o ensaio da Bial (Figura 4b): os dados de absorvância (A 660 nm) foram lineares, pelo menos, ao longo do intervalo de 0 → 0,5 mg / ml de analito (fermento de padeiro RNA), o ensaio ter sido realizado em triplicado (R 2 = regressão 0,99 linear coeficiente). Embora as amostras foram centrifugadas para clarificação antes das medições de absorvância, nenhum precipitado foi encontrado para estas baixas concentrações de analito e, por conseguinte, o passo de centrifugação não era estritamente necessária. O ensaio se desvia da linearidade em concentrações de analito para além desta gama.
• Para o ensaio de Dische (Figura 4c): A 600 nm A 2 = 0,99). A trama de absorvência versus [analito] começou a estabilizar em 0,90 mg / ml de ADN, indicando a fronteira da região de resposta linear.
• Considerações de ordem prática de análise quantitativa ou semi-quantitativa: Para remover o material precipitado, que, de outro modo interferir com a leitura de absorvância, todos os três ensaios requerem centrifugação a velocidades máximas (25000 xg, ou o que quer que limite pode ser suportada pelos tubos de microcentrífuga) para comprimentos de tempo razoáveis (por exemplo, 20 minutos), o que é especialmente importante em altas concentrações de analito. Após a centrifugação, as amostras clarificadas pode ser transferida para uma cuvete ou de microplaca (por exemplo, placas de microtitulação de 96 poços) para as medições de absorvância convenientes.

Figura 1. Árvore de decisão para aplicação dos testes. Começando com uma amostra potencialmente heterogénea de biomoléculas (por exemplo, a partir de lisados ​​de células inteiras), os ensaios colorimétricos descritos aqui podem ser usados ​​para determinar se a mistura contém açúcares não-redutores (teste de Benedict). Se assim for, então o teste orcinol Bial revela ainda se a população de açúcares não redutores contém anéis de pentose (como em DNA ou RNA), versus hexoses (por exemplo, glucose, piranoses outros) e, eventualmente, ainda outras aldoses. Finalmente, se a amostra contiver, pelo menos, uma fracção moderada de DNA, em seguida, o anel de 2'-desoxirribose vai reagir (por acidificação e aquecimento) com o reagente de difenilamina Dische, obtendo-se um produto de condensação visivelmente azul. Note-se que este diagrama é uma árvore de decisão, e não um fluxograma: a lógica dos resultados do ensaio é mostrado serially, mas os ensaios podem ser executados em paralelo.

Figura 2. Reacções químicas subjacentes são mostrados para os ensaios colorimétricos, com o produto detectável cor indicada ao lado as reacções correspondentes. (A) O precipitado insolúvel vermelho de Cu 2 O é o resultado positivo do teste de Benedict de açúcares redutores. (B) Por aquecimento e acidificação, açúcares contendo anéis de pentose decompõe-se e furfural, o qual reage então com orcinol (Bial reagente) para se obter um aduto de azul-esverdeada solúvel. No ensaio de Dische, a falta de um substituinte hidroxilo na posição 2 'permite que uma reacção de oxidação, por abertura de anel, o produto aldeído de que reage posteriormente com difenilamina [(Ph) 2 NH], para se obter um produto de azul brilhante. Química ªructures permanecem desconhecidos para os grandes, produtos multi-anel de condensação dos orcinol (b), e difenilamina (c) As reacções.

Figura 3. Aplicação dos resultados de ensaio colorimétrico para os compostos de referência e das amostras heterogéneas. Amostras são ilustrados para o de Benedict (a), Bial (b), e (c) Dische de ensaios colorimétricos. Em (a) → (c), os sub-painéis esquerdo mostram controles positivos / negativos usando analitos adequadamente reactivos / não reactivo e do direito sub-painéis mostram uma série de titulação para cada analito. Também é mostrado um painel de reacções ilustrativa Dische (d) em que o analito varia na heterogeneidade - quer de ADN sozinho (esquerda), DNA / RNA misturas de diferentes proporções (do meio), ou ADN, na presença de uma proteína associada ao ácido nucleico ( 'HFQ'). Estes painéissão ainda descritas na secção Resultados representativas do texto.

Figura 4. As curvas padrão de ensaios com os compostos de referência. Curvas de calibração são mostradas para o de Benedict (a), (b Bial) e Dische de (c) ensaios, ilustrando uma porção representativa da região de resposta linear para cada ensaio. A análise de regressão linear e ajusta os coeficientes de correlação correspondentes são indicadas para cada ensaio. Levedura de padeiro padrão RNA (b) e timo de vitelo DNA (c) foram os analitos destas séries de titulação. Clique aqui para ver maior figura .

Não há conflitos de interesse declarados.