O perfil de metabólitos não direcionados por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massa (UPLC-MS) é uma técnica poderosa para investigar o metabolismo. Este artigo descreve um fluxo de trabalho típico utilizado para o perfil de metabólitos não direcionados do soro, incluindo organização e preparação de amostras, aquisição de dados, análise de dados, controle de qualidade e identificação de metabólitos.
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Artigo de método
Grande Escala Profiling não-alvo metabolômica de soro por cromatografia líquida de ultra-espectrometria de massa (UPLC-MS)
Neste artigo
Resumo
Resumo
O perfil de metabólitos não direcionados por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massa (UPLC-MS) é uma técnica poderosa para investigar o metabolismo. A abordagem oferece uma análise imparcial e aprofundada que pode permitir o desenvolvimento de testes diagnósticos, novas terapias e aprofundar nossa compreensão dos processos da doença. A diversidade química inerente do metaboloma cria desafios analíticos significativos e não existe uma abordagem experimental única que possa detectar todos os metabólitos. Além disso, a variação biológica no metabolismo individual e a dependência do metabolismo de fatores ambientais exigem um grande número de amostras para atingir o poder estatístico apropriado necessário para uma interpretação biológica significativa. Para enfrentar esses desafios, este tutorial descreve um fluxo de trabalho analítico para o perfil de metabólitos não direcionados em larga escala do soro por UPLC-MS. O procedimento inclui diretrizes para organização e preparação de amostras, aquisição de dados, controle de qualidade e identificação de metabólitos e permitirá a aquisição confiável de dados para grandes experimentos e fornecerá um ponto de partida para laboratórios novos no perfil de metabólitos não direcionados por UPLC-MS.
Introdução
O termo "metabolômica" pode abranger muitas coisas. Por exemplo, um experimento metabolômico pode ser realizado usando uma variedade de plataformas analíticas, como RMN e cromatografia gasosa e/ou líquida acoplada à espectrometria de massa. Além disso, os experimentos metabolômicos podem ser realizados de maneira direcionada ou não direcionada, ou uma combinação de ambos. Um experimento metabolômico direcionado envolverá a análise direcionada de um painel de moléculas importantes para a questão biológica em questão (por exemplo, pequenas moléculas envolvidas no ciclo do TCA permitirão a quantificação precisa dessa via). Nessa situação, a hipótese biológic....
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Protocolo
1. Organização da amostra
- Para criar um mapa de placas para preparação de amostras em uma planilha, na primeira coluna, insira uma lista de amostras em ordem de carregamento. Em uma segunda coluna, insira os locais das placas de 96 poços usando a nomenclatura correta para o software do amostrador automático.
- Guarde um poço em cada placa para amostras de controle de qualidade.
- Se o seu amostrador automático LC puder lidar com duas placas por vez, separe a lista de amostras em lotes de 190 e salve essas informações em uma segunda planilha.
- Dentro de cada um desses lotes, use a função randomize [nota: "=rand()"no Excel] para rand....
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Resultados
As etapas analíticas básicas de um experimento de perfilagem de metabólitos não direcionado por UPLC-MS são descritas na Figura 1. Os dados brutos de cada amostra podem ser visualizados como um cromatograma de pico base. Figura 2 mostra um exemplo de cromatograma de pico base de uma amostra de soro analisada pela opção de gradiente (a) no tutorial. Após a análise estatística conforme descrito acima, tenta-se a identificação dos metabólitos para todas as características moleculares estati.......
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Discussão
Este tutorial destina-se a servir como ponto de partida para a realização de perfis de metabólitos não direcionados em larga escala por UPLC-MS. O fluxo de trabalho é focado em metabólitos que podem ser extraídos com um solvente aquoso de metanol, retidos em uma coluna C8 ou C18 UPLC e detectados como íons positivos. Na situação em que não existe um enviesamento pré-determinado para uma classe específica de metabolitos e se pretende uma hipótese geradora de perfil global, este protocolo é valioso, uma vez que resultará n.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
O tutorial apresentado foi realizado e desenvolvido dentro da Instalação de Proteômica e Metabolômica da Colorado State University, que é parcialmente financiada pelos Recursos de Administração de Pesquisa da CSU para Projetos Acadêmicos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placas de 96 poços - 500 μ l poços | VWR | 40002-020 | Estes são usados para preparação de amostras |
| Tapetes de placa de 96 poços | VWR | 89026-514 | Estes são usados para preparação de amostras |
| Placas de 96 poços - 350 μ l poços | Waters Corporation | WAT058943 | Estes são usados para injeção de amostra |
| 96 esteiras de placa de poço | Waters Corporation | 186000857 | Estes são usados para injeção de amostra |
| 96 selos térmicos de placa de poço | Waters | Corporation 186002789 | Estes podem ser usados para injeção de amostra ou armazenamento de longo prazo |
| 96 selador térmico de placa de poço | Waters Corporation | 186002786 | |
| Metanol de grau LC-MS | Fluka | 34966 | |
| Acetonitrila de grau LC-MS | Fluka | 34967 | |
| Ativador de grau LC-MS | Fluka | 39253 | |
| Ácido fórmico de grau LC-MS | Fluka | 56302 | |
| Pipetador eletrônico multicanal | VWR | 89000-674 | |
| Pontas de pipeta | Eclipse (adquirido através da Light Labs) | B-5061/B-4061 | |
| Centrífuga resfriada - Allegra X-12R | Beckman Coulter | N/A - contato Beckman Coulter | |
| Acquity Sistema de cromatografia líquida de ultra desempenho (UPLC) | Waters Corporation | N/A - contato Waters Corporation | |
| Coluna UPLC C8 (opção de gradiente a) | Coluna Waters Corporation | 186002876 | |
| UplC T3 (opção de gradiente b) | Waters Corporação | 186003536 | |
| Xevo G2 Q-TOF Espectrômetro de massa | Waters Corporation | N/A - entre em contato com a Waters Corporation |
Referências
- Theodoridis, G., Gika, H. G., Wilson, I. D. Mass Spectrometry-Based Holistic Analytical Approaches for Metabolite Profiling in Systems Biology Studies. Mass Spectrom. Rev. 30, 884-906 (2011).
- Zelena, E., et al.
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Reimpressões e permissões
