Separação de Ectoderma embrionárias de camundongos Facial e mesênquima

Resumo

Um protocolo para a separação da ectoderme embrionária facial e mesênquima é descrito. Usamos Dispase II para tratar embriões inteiros primeiro, dissecar todo proeminências faciais, e então separar o ectoderma facial e mesênquima.

Resumo

Fendas orofaciais são os defeitos mais freqüentes craniofaciais, que afetam 1,5 em 1000 ^1,2 recém-nascidos em todo o mundo. Fissuras orofaciais é causada por ^três desenvolvimento anormal facial. No ser humano e do rato, o crescimento inicial e padronização da cara depende de várias papilas pequenas de tecido, as proeminências faciais ^4,5. O rosto é derivado de seis principais destaques: emparelhados processos frontais nasais (FNP), proeminências maxilares (MXP) e proeminências mandibulares (MDP). Estes consistem de proeminências inchaços de mesênquima que estão incorporados em um epitélio de revestimento. Estudos realizados em várias espécies têm mostrado que a sinalização crosstalk entre ectoderma facial e mesênquima é crítico para a formação da face ^6. No entanto, os detalhes mecanísticos sobre os genes envolvidos nestes relés de sinalização são escassos. Uma maneira de obter uma compreensão abrangente da expressão do gene, fator de transcrição de ligação, e marcas de cromatina associados ao desenectoderme pingue facial e mesênquima é isolar e caracterizar os compartimentos dos tecidos separados.

Aqui apresentamos um método para separar ectoderma facial e mesênquima no dia embrionário (E) 10,5, uma fase crítica de desenvolvimento na formação do mouse facial que precede a fusão dos destaques. O nosso método é adaptado a partir do método já anteriormente utilizado para dissecar proeminências faciais ^7. Neste estudo anterior havia sido empregado C57BL inato / 6 ratos como esta cepa se tornou um padrão para a genética, morfologia facial genômica e ^8. Aqui, no entanto, devido às quantidades mais limitadas de tecido disponível, nós utilizamos a estirpe CD-1 outbred que é mais barata para comprar, mais robusto para a criação, e que tende a produzir mais embriões (12-18) por ninhada do que qualquer inbred rato tensão ^8. Seguindo o isolamento do embrião, neutro protease Dispase II foi usada para tratar o embrião inteiro. Em seguida, as proeminências faciais foram dissecared para fora, e a ectoderme facial foi separado do mesênquima. Este método mantém tanto ectoderme facial e mesênquima intacta. As amostras obtidas utilizando este método pode ser usado para a detecção de proteínas, incluindo as técnicas, a imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ensaio, os estudos de microarranjos e RNA-seq.

Protocolo

1. Prepare Dispase II

1. Preparar uma solução fresca de Hepes-solução salina tamponada (HBS) (50 mM de Hepes / KOH, pH 7,4, 150 mM NaCl). Adicionar 2 ml de 0,5 M de tampão Hepes / KOH a pH 7,4 e 1,2 ml de 2,5 M de NaCl em 16,8 ml de H ₂ O. Ultrapure
2. Faça 10 mg / ml Dispase II. Pesar 0,2 g Dispase II (Roche, Cat. # 4942078001) e dissolver em 20 ml de HBS. Preparar 1,0 ml alíquotas em tubos de Eppendorf individuais, e armazenar a -20 ° C para armazenamento a longo prazo.
3. Diluir 10 mg / ml Dispase II 1:10 em PBS antes da utilização. Coloque a Dispase II diluído em gelo.

2. Dissecar CD-1 embriões E10....

Resultados

Após tratamento Dispase II, a ectoderme do embrião tende a ser solto. As proeminências faciais devem estar intacto após dissecção (Figura 2A). O ectoderma facial isolada é clara e livre de mesênquima tecido (Figura 2B). Para determinar a eficácia do protocolo e para detectar a contaminação cruzada nós ensaiadas para prosencéfalo expressaram Zic3 ^9, ectodérmica específico CDH1 ⁵ e mesenquimal específico SOX10 ¹⁰ utilizando transcriptase reversa PCR. Nosso.......

Discussão

Este protocolo fornece um método simples para separar ectoderma rato embrionário mesênquima facial e base em uma primeira etapa de tratamento Dispase II. Em estudos anteriores, temos realizado dissecção das proeminências faciais antes Dispase tratamento II, mas temos de forma consistente que o mesênquima se torna "pegajoso" e mais difícil de manipular. Nosso novo protocolo evita esse problema. Combinação Dispase II tratamento com força física suave pipetando para cima e para baixo faz a separação de ectoderma .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dispase II (protease neutra, grau II)	Roche	4942078001	Fazer 10 mg/ml de solução-mãe Dispase II em HBS. Alíquota e loja em -20 ° C .
RNAlater	Ambion	AM7021