Peixe-zebra são um sistema emergente para modelar doenças humanas do músculo esquelético. Nós descrevemos um método rápido e eficiente para isolar fibras musculares do músculo esquelético de peixe-zebra embrionário e larval. Este método conduz a uma preparação de alta densidade de células musculares adequado para o estudo da morfologia da fibra muscular esquelética única, a localização subcelular de proteínas, e da fisiologia do músculo.
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Artigo de método
Análise de Desenvolvimento Embrionário e larval Zebrafish esqueléticos miofibras de Preparações dissociadas
Neste artigo
Resumo
Resumo
O peixe-zebra tem provado ser um sistema modelo valioso para explorar a função do músculo esquelético e para o estudo de doenças musculares humanas. Apesar das muitas vantagens oferecidas por análise in vivo de músculo esquelético, no peixe-zebra, visualizando o meio complexo e finamente estruturado proteína responsável pela função muscular, particularmente, em todo o embrião, pode ser problemático. Este impedimento resulta de o pequeno tamanho do músculo esquelético do peixe-zebra (60 mM) e o tamanho ainda menor do sarcómero. Aqui nós descrevemos e demonstrar um método simples e rápido para isolar miofibras esqueléticas a partir de embriões de peixes-zebra e larvas. Nós também incluímos protocolos que ilustram as técnicas de preparação de pós úteis para analisar a estrutura e função muscular. Especificamente, detalhar a localização imunocitoquímica posterior das proteínas do músculo esquelético e da análise qualitativa da liberação de cálcio estimulada através de imagem de cálcio de células vivas. No geral, este vídeoartigo fornece um método direto e eficaz para o isolamento e caracterização de fibras musculares esqueléticas de peixe-zebra, uma técnica que proporciona um canal para estudos subsequentes miríade de estrutura e função musculares.
Introdução
O músculo esquelético é um tecido altamente especializado responsável por gerar as forças necessárias para a motilidade contráteis. A contração é iniciada através de um processo conhecido como excitação-contração (CE) acoplamento que converte os sinais elétricos para liberação de cálcio dos estoques intracelulares 1,2. Liberação de cálcio intracelular ativa o sarcômero para encurtar e gerar força. Os vários componentes específicos do maquinário molecular responsável por mediar a transmissão junção neuromuscular 3, acoplamento CE 4,5 e actina e miosina contrações dependentes 6 continuam a ser objecto de investigação em curso....
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Protocolo
1. Preparação de poli-L-lisina revestido Lamelas (Tempo: 1 hora)
Lamelas de revestimento permite a rápida colonização myofiber e aderência. Isto pode ser realizado durante o passo de dissociação do isolamento de células musculares (passo 2 abaixo).
- Cortar e colocar Parafilm na parte inferior de uma placa de Petri de 60 mm (qualquer marca).
- Coloque deslizamentos de vidro da tampa do microscópio (12 mm de diâmetro) em Parafilm em um 60 milímetros de cultura de tecidos prato ou colocá-los individualmente em poços individuais de placas de 24 poços.
Nota 1: Estas pequenas lamelas redondas....
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Resultados
Imunomarcação fluorescente de miofibras (Figura 2)
As imagens mostram o esperado padrão de marcação fluorescente de miofibras imunocoradas após o isolamento bem sucedido e revestimento. As fibras têm sido marcada ou com anti-receptor de rianodina (1:100) (figura 2A) ou anti-α-actinina (1:100) (Figura 2B), anticorpos, e revelam imunocoloração da tríade e a banda Z respectivamente. Os anticorpos secundários utilizados foram Alexa Fluo.......
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Discussão
Zebrafish são um poderoso sistema modelo para o estudo de vertebrados desenvolvimento muscular e função in vivo 25,27,28. Eles também têm emergido como um recurso valioso para a modelagem de doenças musculares humanos 14,15,20,29. Enquanto grandes avanços têm sido tomadas para promover o uso e aplicação de peixe-zebra para o estudo da função muscular e doença muscular, há uma necessidade crítica constante para desenvolver ferramentas que permitem análise mais aprofundada que complementa a .......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer aos membros do laboratório Dowling (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, e William Telfer) que contribuíram para o desenvolvimento da técnica e da produção do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Taubman, do Departamento de Pediatria da Universidade de Michigan, e em parte, de doações da Associação de Distrofia Muscular (JJD MDA186999) e os Institutos Nacionais de Saúde (JJD 1K08AR054835).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de cultura de 24 poços | Corning | 3524 | |
| 10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 Meio independente | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| Collagenase Tipo II | Worthington | Bioquímica LS004186 | Lote 41H12764 |
| Colagenase Tipo IV | Worthington Bioquímica | L5004188 | |
| 8% Paraformaldeído | Microscopia Eletrônica Ciências | 157-8 | |
| Metanol | Sigma | 322415 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Soro de ovelha | Sigma | S3772 | |
| Soro de cabra | Sigma | G9023 | |
| Lamínulas de vidro | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| Poli-L-Lisina | Sigma | P4707 | |
| Pronase | Sigma | P5147 | |
| 40 μ m Filtro | BD Biosciences | 352340 | |
| 70 μ m Filtro | BD Biosciences | 352350 | |
| Prolong Gold antifade reagente | Invitrogen | P36931 | |
| Anti-alfa;-Actinina | anticorpo Sigma | A5044 | |
| Anti-RYR | Abcam | 34C | |
| Alexa Fluor anticorpo | Invitrogen | A-21425 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
| Placa de Petri de 60 mm | Fischerbrand | 0875713A | |
| Poli-L-Ornitina | Sigma | P4957 | |
| Lâmina de microscópio | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| Cafeína | Sigma | C0750 |
Referências
- Dulhunty, A. F. Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).
- Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal....
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Reimpressões e permissões
