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Artigo de método

Análise de Desenvolvimento Embrionário e larval Zebrafish esqueléticos miofibras de Preparações dissociadas

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DOI:

10.3791/50259

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13 de novembro de 2013

 ,  ,  ,  , 
1Departments of Pediatrics and Neurology, University of Michigan

Neste artigo

Resumo

Peixe-zebra são um sistema emergente para modelar doenças humanas do músculo esquelético. Nós descrevemos um método rápido e eficiente para isolar fibras musculares do músculo esquelético de peixe-zebra embrionário e larval. Este método conduz a uma preparação de alta densidade de células musculares adequado para o estudo da morfologia da fibra muscular esquelética única, a localização subcelular de proteínas, e da fisiologia do músculo.

Resumo

O peixe-zebra tem provado ser um sistema modelo valioso para explorar a função do músculo esquelético e para o estudo de doenças musculares humanas. Apesar das muitas vantagens oferecidas por análise in vivo de músculo esquelético, no peixe-zebra, visualizando o meio complexo e finamente estruturado proteína responsável pela função muscular, particularmente, em todo o embrião, pode ser problemático. Este impedimento resulta de o pequeno tamanho do músculo esquelético do peixe-zebra (60 mM) e o tamanho ainda menor do sarcómero. Aqui nós descrevemos e demonstrar um método simples e rápido para isolar miofibras esqueléticas a partir de embriões de peixes-zebra e larvas. Nós também incluímos protocolos que ilustram as técnicas de preparação de pós úteis para analisar a estrutura e função muscular. Especificamente, detalhar a localização imunocitoquímica posterior das proteínas do músculo esquelético e da análise qualitativa da liberação de cálcio estimulada através de imagem de cálcio de células vivas. No geral, este vídeoartigo fornece um método direto e eficaz para o isolamento e caracterização de fibras musculares esqueléticas de peixe-zebra, uma técnica que proporciona um canal para estudos subsequentes miríade de estrutura e função musculares.

Introdução

O músculo esquelético é um tecido altamente especializado responsável por gerar as forças necessárias para a motilidade contráteis. A contração é iniciada através de um processo conhecido como excitação-contração (CE) acoplamento que converte os sinais elétricos para liberação de cálcio dos estoques intracelulares 1,2. Liberação de cálcio intracelular ativa o sarcômero para encurtar e gerar força. Os vários componentes específicos do maquinário molecular responsável por mediar a transmissão junção neuromuscular 3, acoplamento CE 4,5 e actina e miosina contrações dependentes 6 continuam a ser objecto de investigação em curso intenso. Além disso, as proteínas que estabilizam a membrana muscular durante 7,8 contracção e que medeiam a sinalização entre a fibra muscular e da matriz extracelular 7,9 foram identificados e estudados em grande detalhe.

As mutações em vários genes importantes para a estrutura de um músculofunção nd foram identificados como causas de doenças do músculo esquelético humano ( http://www.musclegenetable.org/ ). Estas doenças, classificadas amplamente como miopatias e distrofias musculares esqueléticas com base em características clínicas e histopatológicas, estão associadas com fraqueza muscular, deficiência ao longo da vida, e 10,11 mortalidade precoce. O peixe-zebra tem provado ser um sistema excelente para modelar e estudar as doenças do músculo esquelético humanos 8,12,13. Ele tem sido empregado para validar as novas mutações genéticas 8, definir novos aspectos da doença fisiopatologia 14,15, e identificar novas abordagens terapêuticas 15,16. A potência do peixe-zebra para o estudo da doença muscular humana refere-se a um grande número de descendentes, o rápido desenvolvimento da estrutura muscular e na função, a clareza óptica do embrião do peixe-zebra, e a facilidade da manipulação genética e farmacológica da zebra desenvolvimentopeixe 17.

Nós e outros 12,18,19 recentemente desenvolvida uma técnica simples para o isolamento rápido e eficiente de miofibras do peixe-zebra desenvolvimento. Esta metodologia permitiu o exame de miofibras em maior detalhe do que pode ser fornecida por análise de embrião inteiro. A técnica tem sido explorada para a caracterização da proteína de localização subcelular 20, bem como para a identificação de características histopatológicas importantes como parte de estudos de validação em modelos de doença recentemente desenvolvidos 21. Além disso, fibras musculares isolados podem ainda ser usado para geração de imagens ao vivo e para estudos eletrofisiológicos 22, técnicas que permitam o interrogatório dos aspectos-chave da função muscular. O protocolo específico para o isolamento de células musculares, junto com dois exemplos de experiências analíticas subseqüentes, é detalhado nas partes restantes deste manuscrito.

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Protocolo

1. Preparação de poli-L-lisina revestido Lamelas (Tempo: 1 hora)

Lamelas de revestimento permite a rápida colonização myofiber e aderência. Isto pode ser realizado durante o passo de dissociação do isolamento de células musculares (passo 2 abaixo).

  1. Cortar e colocar Parafilm na parte inferior de uma placa de Petri de 60 mm (qualquer marca).
  2. Coloque deslizamentos de vidro da tampa do microscópio (12 mm de diâmetro) em Parafilm em um 60 milímetros de cultura de tecidos prato ou colocá-los individualmente em poços individuais de placas de 24 poços.

Nota 1: Estas pequenas lamelas redondas ajudam a concentrar myofiber números e reduzir o excesso de uso de anticorpos.

Nota 2: Outras lamelas tamanho vai funcionar, no entanto, os volumes de reagentes e embriões utilizados deverão ser ajustados em conformidade.

  1. Pipeta de 50-200 ul de solução de poli-L-lisina (0,01%) em cada tampa de vidro numa placa de Petri.
  2. Permitir as lamelas de sentar-se pelo menos um hour a 37 ° C. Incubações mais longas não vai influenciar negativamente os resultados.
  3. Remove-poli-L-lisina solução da tampa de vidro e lavar duas vezes com um mínimo de 100 l 1x PBS.
  4. Permitir lamelas secar.
  5. Lamelas está agora pronto para miofibras.

Nota 3: A fim de garantir a esterilidade, o revestimento pode ser feito de um capô e em lamelas autoclavados.

Nota 4: Mantenha a placa de Petri de 60 mm e Parafilm na parte inferior. Esta configuração será usada durante myofiber revestimento e imunomarcação (posteriores passos).

Alternativa 1: Em vez de lamelas de revestimento imediatamente antes da utilização, um estoque lamela revestida pode ser utilizado. Um prato de 60 milímetros de Petri contendo um mínimo de 2 ml de poli-L-lisina pode ser armazenado a 4 ° C contendo numerosas lamelas. Com esta alternativa começar no passo 1.5 para processar as lamelas de miofibras.

Alternativa 2: Também lamelas de casaco em poli-L-ornitina. To é mais trabalhosa, mas é útil para a cultura de longo prazo, porque lamelas revestidas com poli-L-ornitina pode ser tratado UV. Com o tratamento UV e técnica estéril cuidado myofibers ao vivo geralmente pode ser mantidas em cultura 4-7 dias.

2. A dissociação de embriões Zebrafish e chapeamento de fibras musculares (Tempo: 1 a 3 hr)

Nota: o protocolo padrão se aplica melhor a 3 dpf (dias após a fertilização) Embriões.

  1. Transferência de embriões de peixes-zebra em um tubo de centrífuga de 1,5 ml padrão e remover o máximo de água de peixe possível. Tipicamente, pode ser utilizada 10-20 embriões por tubo, embora menos. Usando mais do que 20-25 embriões muitas vezes resulta numa preparação de densidade excessiva.
    1. Retirar córions antes da dissociação, utilizando manualmente # 5 fórceps. Alternativamente, a remoção do cório químico é conseguido através de um tratamento de 10-15 min com Pronase. Normalmente, a remoção prévia do córion só é necessária quando a confirmação prévia de um mutÉ necessário fenótipo formiga ou morfologia, ou quando usar estágios em que os embriões são naturalmente chocado de seu córion.
  2. Adicionar 900 ul de CO 2 meios independentes para o tubo contendo os embriões.
  3. Adicionar 100 ul de colagenase tipo II, concentração final de 3,125 mg / ml (solução de colagenase a 31,25 mg / mL diluído em PBS 1x), para começar a dissociação. Colagenase IV também pode ser utilizado para a dissociação.
  4. Rode embriões num agitador orbital, e tritura-se a cada 30 min em temperatura ambiente usando um P1000 Pipetman para a trituração.

Nota 2: Acompanhar atentamente dissociação embrião; sobre ou sob a dissociação (especialmente over) são as razões mais comuns para a falha de protocolo. Os tempos para a digestão irá variar dependendo da intensidade de trituração, o número de embriões por tubo, e idade dos embriões. É também muitas vezes menos (em comparação com os tipos selvagens) para embriões de mutantes do músculo esquelético.

Nota3: tempo de digestão médio por idade embrião: 1 dpf = 1 hora, 2 dpf = 1,5 hr, 3 dpf = 2 horas e 4 dpf = 2-2,5 horas.

  1. Pare de digestão quando há embriões inteiros são visíveis, mas pedaços sólidos ainda são visíveis - isto é essencial para prevenir overdigestion.
  2. Tubos de centrífuga com embriões dissociadas em 0,8-2,3 g durante 3-5 minutos para as células de pelotas.
  3. Remover o sobrenadante de células peletizadas e lavar 2x com CO 2 a mídia independente.
  4. Adicionar fresco CO 2 mídia independente para ressuspender as células. 1 ml é normalmente usado para preparações de 10-20 embriões. O volume pode ser dimensionado com base no número de embriões.
  5. Usando uma pipeta P1000, passar a suspensão através de um filtro de embriões de 70 mM. Isso ajuda a remover os resíduos indesejáveis ​​do prep.

Nota 4: suspensão de embriões pode ser filtrado uma segunda vez, através de um filtro de 40 um para remover mais restos não desejados. A partir de uma dupla filtração, a recuperação é approximdiatamente 800 mL de um volume inicial de 1 ml.

  1. Adicionar cerca de 50-100 ul de suspensão de células musculares para cada lamela revestida com poli-L-lisina.

Nota 5: Execute o passo 2.9 em placas de Petri com Parafilm no fundo, previamente preparado. O Parafilm mantém a suspensão de células musculares de correr as lamelas revestidas. Manter placas de Petri cobertas para evitar a evaporação.

  1. Permitir myofibers para resolver aproximadamente 1 hora para as lamelas revestidas à temperatura ambiente.

Nota 6: fibras musculares começam a se estabelecer dentro de 5-10 min. No entanto, para uma boa pega myofiber, recomenda-se um mínimo de 1 hora (1-2 h). Permitindo myofibers que se contentar com mais tempo não irá prejudicar a preparação. Para incubações mais longos (incluindo durante a noite), os antibióticos podem ser adicionados aos meios de comunicação. Com antibióticos e técnica estéril culturas vivas geralmente pode ser mantida por 1-2 dias.

  1. Vivo myofibers pode ser observado neste ponto. Miofibras a partir de embriões 2 dpf e mais tarde será visto como células alongadas e estriadas (Figura 1). Neste ponto, myofibers agora está pronto para análise ao vivo ou por imunomarcação.

Nota 7: O músculo esquelético a partir de 1 dpf embriões não placa fibras como alongados e claramente estriados. Em vez disso, grandes myoballs são visíveis. Além disso, durante a fase de granulação de pós de dissociação (passo 2.6), um dpf myoballs precisam de ser centrifugada durante um mínimo de 8 minutos a 5.000 xg, para atingir um sedimento. Para a análise de embriões, nesta fase, recomenda-se usar a linha transgénica que expressa EGFP especificamente no músculo esquelético 23. Isto irá permitir a identificação de células de origem muscular versus outras fontes.

3. Fluorescência imunocoloração de dissociadas Zebrafish miofibras (Tempo: cerca de 1 dia)

3.1. Imunomarcação

  1. Retire uma porçãomedia de fibras musculares aderidas à lamela revestido
  2. Fix células usando 4% de paraformaldeído ou metanol. Para PFA, retire ½ o volume de mídia e substituir com a mesma quantidade de PFA. Correção para 10 min à temperatura ambiente, em seguida, remova volume total, substitua por 50-100 mL de PFA, e corrigi por mais 10 min. Para a fixação de álcool, metanol arrefecido em gelo ou acetona pode ser aplicado a 4 ° C durante 10 minutos ou 5 minutos, respectivamente.
  3. Lavar miofibras, pelo menos, 3-5x com PBS 1x ou 1x PBS mais 0,1% de Tween. O volume médio de lavagem é 50-100 mL por lamela.
  4. Adicionar solução para miofibras (trabalhando estoque) de bloqueio e incubar 20-60 minutos em temperatura ambiente. A solução de bloqueio irá variar dependendo dos anticorpos primários e secundários. Os dois mais comuns usadas no laboratório são: (1) PBS 1x, 2 mg / ml de BSA, 1% de soro de ovelha, 0,25% de Triton X-100 final e (2) 0,2% de Triton X-100, 2 mg / ml (0,2 % de BSA) e 5% de soro de ovelha / cabra.
  5. Remova a solução de bloqueio e adicionar anticorpo primário diluído em qualquer bsolução ou PBS bloqueio. Incubar miofibras durante a noite a 4 ° C. Certifique-se de ambos os Parafilm ou embrulhe em Saran Wrap placa de Petri contendo as lamelas carregados de fibra muscular revestidas com anticorpos. Pequenos pedaços de toalha de papel humedecido pode ser adicionado para criar uma câmara humidificada.
  6. Remover o anticorpo primário e lava-se a partir de lamelas lamelas de 3-5x durante 5 minutos com PBS ou solução de bloqueio.
  7. Adicionar anticorpo secundário na concentração adequada diluída em 1x PBS ou solução de bloqueio durante 1-2 horas à temperatura ambiente.
  8. Remover o anticorpo secundário e lava-miofibras 3-5x em PBS durante 5 minutos cada à temperatura ambiente.

3.2. Lamelas de montagem

  1. Aplicar 1-2 gotas de reagente antifade a uma lâmina de microscópio.
  2. Cuidadosamente pick-up a lamela revestido e immunolabled usando uma pinça e lugar (myofibers para baixo) a lamela sobre o reagente antifade na lâmina de microscópio.

Nota 1: Atenção para a orientação do clamela oated é crítica.

  1. Coloque 1-2 Kimwipes sobre uma superfície sólida duro. Inverter rapidamente o slide com as lamelas revestidas descansando sobre o reagente antifade e colocá-lo (lamela para baixo) na Kimwipes.
  2. Aplicar uma leve pressão para os cantos da lâmina de microscópio para remover o excesso de Antifade e formar uma vedação estanque entre a lâmina e lamela
  3. Permitir a Antifade restante secar durante 5-10 min à temperatura ambiente, em seguida, as fibras musculares estão prontos para a imagem (Figuras 2A e B) ou armazenar a 4 ° C.

4. Vivo celular Imagem de cálcio Usando GCaMP3

Experiências de células vivas pode ser realizada em miofibras antes da fixação (passo seguintes 2.10). O protocolo seguinte descreve a imagem ao vivo em miofibras expressando GCaMP3 24, um indicador de cálcio geneticamente codificado, expressa pelo específica zebrafish actina-α promotor músculo esquelético (pSKM) 23. Alternativamente,esta técnica pode ser facilmente adaptado para utilizar corantes indicadores de cálcio tais como o Fura-2.

  1. Injetar embriões com pSKM: GCaMP3 construir na fase 1-2 celular
  2. Aos 3 dpf, coletar as larvas e preparam myofibers conforme descrito nas seções 1 e 2. Permitir miofibras-se aderir durante um período mínimo de 1 hora. Para esta técnica, que se preparam lamelas em pratos de 24 poços, é necessária.
  3. Remova cuidadosamente qualquer excesso de mídia, e adicionar 300 ml de CO 2 mídia independente fresco à temperatura ambiente.
  4. Observar células sob um microscópio invertido. GCaMP3 myofibers positivos deve ser visível sob fluorescência verde.
  5. Configure câmera para a gravação, se desejar.
  6. Prepare uma solução de cafeína 30 mM em CO 2 mídia independente. Para estimular as células, Pipeta suavemente 300 ml de solução de cafeína para o bem sob ampliação. Dentro 5-10 seg, GCaMP miofibras positivas deve responder a cafeína com um aumento rápido na fluorescência (Figura 3). Myofibers também podem contrair. De nota, a cafeína induz a liberação de cálcio do retículo sarcoplasmático das lojas 25. Outros agentes, tais como KCl 26 e ryanodine 4, pode ser usado para estudar liberação induzida de cálcio.

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Resultados

Imunomarcação fluorescente de miofibras (Figura 2)

As imagens mostram o esperado padrão de marcação fluorescente de miofibras imunocoradas após o isolamento bem sucedido e revestimento. As fibras têm sido marcada ou com anti-receptor de rianodina (1:100) (figura 2A) ou anti-α-actinina (1:100) (Figura 2B), anticorpos, e revelam imunocoloração da tríade e a banda Z respectivamente. Os anticorpos secundários utilizados foram Alexa Fluo...

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Discussão

Zebrafish são um poderoso sistema modelo para o estudo de vertebrados desenvolvimento muscular e função in vivo 25,27,28. Eles também têm emergido como um recurso valioso para a modelagem de doenças musculares humanos 14,15,20,29. Enquanto grandes avanços têm sido tomadas para promover o uso e aplicação de peixe-zebra para o estudo da função muscular e doença muscular, há uma necessidade crítica constante para desenvolver ferramentas que permitem análise mais aprofundada que complementa a ...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer aos membros do laboratório Dowling (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, e William Telfer) que contribuíram para o desenvolvimento da técnica e da produção do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Taubman, do Departamento de Pediatria da Universidade de Michigan, e em parte, de doações da Associação de Distrofia Muscular (JJD MDA186999) e os Institutos Nacionais de Saúde (JJD 1K08AR054835).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de cultura de 24 poçosCorning3524
10x PBSInvitrogen Gibco70011
CO2 Meio independenteInvitrogen Gibco18045
Collagenase Tipo IIWorthingtonBioquímica LS004186Lote 41H12764
Colagenase Tipo IVWorthington BioquímicaL5004188
8% ParaformaldeídoMicroscopia Eletrônica Ciências157-8
MetanolSigma322415
Triton X-100SigmaX100
BSASigmaA2153
Soro de ovelhaSigmaS3772
Soro de cabraSigmaG9023
Lamínulas de vidroFischerbrand12-545-82 12CIR-1D
Poli-L-LisinaSigmaP4707
PronaseSigmaP5147
40 μ m FiltroBD Biosciences352340
70 μ m FiltroBD Biosciences352350
Prolong Gold antifade reagenteInvitrogenP36931
Anti-alfa;-Actininaanticorpo SigmaA5044
Anti-RYRAbcam34C
Alexa Fluor anticorpoInvitrogenA-21425
TWEEN 20SigmaP1379
Placa de Petri de 60 mmFischerbrand0875713A
Poli-L-OrnitinaSigmaP4957
Lâmina de microscópioFischerbrand12-550-15
CafeínaSigmaC0750

Referências

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