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1. Fixação
Fixadores são cancerígenas; usar luvas e lidar com os fixadores em uma coifa. Salvo indicação em contrário, todas as incubações são realizadas em gelo e todas as soluções devem ser filtrados antes da utilização. Use microscopia eletrônica de grau de reagentes.
Dia 1
- Após condições experimentais (por exemplo, injecção viral, o tratamento medicamentoso), colocar a membrana com organotípicas de fatias do hipocampo de 60 x 15 mm de poliestireno placa de Petri contendo gelada de tampão fosfato 0,1 M (tampão de Sorensen fosfato), pH 7,3. Adicionar 1 - 2 ml de tampão fosfato 0,1 M directamente em cima das fatias para mantê-las frias.
Passo crítico: Sempre utilize buffers recém preparados e fixadores. Certifique-se de que o pH do tampão está dentro do intervalo desejado. A incapacidade de fazê-lo pode danificar estruturas celulares.
- Para isolar o subcampo CA1 do corte, usar umdescartável bisturi para cortar suavemente através da próxima fatia a DG, em paralelo com a camada de células CA1 (Figura 1). Em seguida, corte a fatia restante verticalmente para remover o subcampo CA3 eo subículo. Cortado um canto da fatia para ajudar a identificar a superfície superior do tecido.
NOTA: No caso de nenhum de entrega viral de proteína de interesse é necessária, a fatia de tecido inteiro pode ser fixada após o meio é removido com uma suave lavagem de tampão arrefecido com gelo. Isto é então seguido por corte para fora do CA1.
Passo crítico: Acompanhe a parte de cima do tecido para que corte apropriado das grades mais tarde.
- Cuidadosamente remover o tecido a partir da membrana usando a parte traseira do bisturi. Usar uma pipeta de Pasteur para transferir cuidadosamente o tecido a uma placa de 12 poços contendo 0,1 M de tampão fosfato.
- Remover o tampão no poço da placa e adicionar 500 & mu, l - 1 ml de fixador gelada (pH 7,3) composta do seguinte: 0,1% de ácido pícrico, paraformaldeído a 1%, e 2,5% de glutaraldeído em tampão de fosfato 0,1 M. Incubar durante 2 horas a 4 ° C.
NOTA: ácido pícrico pode ser explosivo quando seco. Mantenha-o molhado com água em um recipiente bem fechado. Armazenar em local seco e bem ventilado.
- Remova o fixador do poço e lavar as amostras 3 vezes (20 minutos cada) em tampão de fosfato 0,1 M.
- Incubar durante 40 min em 1% de ácido tânico (w / v) em 0,1 M de tampão de maleato, pH 6,0.
- Lavar duas vezes (20 minutos cada) em tampão de maleato.
- Incubar durante 40 min, em acetato de uranilo a 1% (w / v) em tampão de maleato no escuro. Acetato de uranilo é sensível à luz e é radioactivo. Cobrir a proveta com Parafilm ao dissolver-se e armazenar qualquer tampão não utilizado no escuro a 4 ° C.
- Lavar duas vezes (20 minutos cada) em tampão de maleato.
- Incubar durante 20 min em 0,5% de cloro platinaide (w / v) em tampão de maleato.
- Lavar duas vezes (20 minutos cada) em tampão de maleato. Armazenar as amostras a 4 ° C até estarem prontos para processamento adicional.
2. Desidratação e incorporação
Óxido de propileno é cancerígeno. Evite vapores por trabalhar com ele em uma coifa. Use absoluto, etanol puro a 100%, que não contém qualquer traço de água. Diluir esta etanol absoluto para produzir diferentes concentrações de desidratação.
Dia 2
- Incubar durante 5 min em etanol a 50% e, em seguida, durante 5 min em etanol a 70%.
- Incubar durante 15 min, em recém-preparados a 1% de p-fenilenodiamina (PPD) em etanol a 70%.
- Enxaguar três vezes em etanol a 70%.
- Incubar durante 5 min em etanol a 80% e, em seguida, durante 5 min em etanol a 95%.
- Incubar em etanol 100% duas vezes por 5 minutos de cada.
- Prepare frascos de vidro com tampas de rosca e verifique se eles são limpos e completamente secos. Transferir as fatias de frascos de vidro erotular cada frasco simples e clara.
- Incubar durante 5 min em 1:1 etanol: óxido de propileno.
- Incubar em óxido de propileno a 100% duas vezes por 5 minutos de cada.
- Adicionar resina (Epon) a cada frasco para dar uma mistura 1:1 com o óxido de propileno. Misture delicadamente para 2 horas. Não agite os frascos muito rigor para evitar bolhas que possam interferir com a incorporação.
- Adicionar resina para fazer uma mistura 3:1 de óxido de propileno, e mistura-se durante 2 h.
- Transferir a resina 100% e incubar O / N.
Dia 3
- Amostras sanduíche entre as tiras de plástico ACLAR e cura durante 24 horas a 60 ° C.
3. Corte e montagem em Grids
Dia 4
- Cortar semi-finas (0,5 mm) e as secções coradas com azul de toluidina a 1% + 1% de bórax para determinar a orientação correcta de amostras.
- Corte cortes ultrafinos (60 nm) e montar em grades de níquel, uma seção por grade.
4. Imunohistoquímica
Todos os amortecedores e água deve ser filtrada antes de usar.
Dia 5
- Colocar uma gota (~ 50 ul) de tampão de Tween-20/phosphate 1% (T / PB), pH 7,5, em um pedaço de Parafilm limpo sobre uma superfície plana. Gentilmente pegar a grade com fórceps limpas pela extremidade e flutuar sobre o tampão, a secção abaixo, e incubar durante 10 min à TA.
- Drenar o excesso de líquido a partir da rede, colocando-se na secção do lado de papel de filtro e, em seguida, flutuar na glicina 50 mM em T / PB, durante 15 minutos à temperatura ambiente.
Passo crítico: Para evitar o excesso de "carry-over" de soluções a partir de uma gota de solução para o próximo durante as incubações, drenar o excesso de líquido por tocar suavemente a borda da grade em # 1 filtro de papel entre cada mudança de solução. Também remover qualquer solução de presa entre os braços da pinça EM prende a grade por wicking suavemente com um pedaço de papel de filtro entre os braços de pinça enquanto ensutocar os seções não seque completamente.
- Seca-se a grelha com papel de filtro e, em seguida, flutuar na solução de bloqueio contendo BSA a 2,5% e 2,5% de soro a partir do animal de que o anticorpo secundário em T / PB, durante 30 min à TA.
- Incubar com o anticorpo primário (em T / PB), à TA ou O / N a 4 ° C. O tempo óptimo e a temperatura de incubação, assim como a concentração do anticorpo, devem ser determinadas experimentalmente.
- Lava-se a grelha de três vezes (2 minutos cada) com T / PB.
- Incubar com o anticorpo secundário (anti-coelho de 01:20 ou anti-rato acoplado a ouro de 10 nm), durante 1 h à TA.
- Lavar três vezes (2 minutos cada) com T / PB.
- Postfix com glutaraldeído a 2% em T / PB, durante 5 min.
- Lavar três vezes (2 minutos cada) com T / PB e, em seguida, três vezes (2 minutos cada) com água filtrada.
- Incubar com acetato de uranilo a 2% em água durante 10 min.
Enquanto a grade é a coloração, a preparar uma câmara de CO 2-livre por placinga pedaço de Parafilm no centro de uma placa de Petri de vidro. Em seguida, coloca 4-6 pellets de NaOH no prato em torno do Parafilm para absorver CO 2 no ar. Manter a parte superior fechada por alguns minutos. Usar uma pipeta de Pasteur e rápida transferência de um pequeno volume de solução de citrato de chumbo de Reynold para o Parafilm no prato de Petri de vidro. Abrir a parte superior apenas o suficiente para inserir a pipeta de Pasteur para minimizar a re-introdução de CO 2 para a câmara.
NOTA: Para fazer a solução de Reynold citrato de chumbo, ferver 100 ml de água deionizada em um forno de microondas e deixe esfriar em um recipiente hermético. Num balão volumétrico de 50 ml com rolha, misturar 1,33 g de nitrato de chumbo, 1,76 g de citrato de sódio e 30 ml de água fervida, mediante agitação vigorosa durante 1 min. Em seguida, agitar intermitentemente por 30 min. A esta solução turva, adicionar 8 ml de hidróxido de sódio 1 M e, lentamente, inverter o frasco algumas vezes. Solução se tornará claro. Levar a solução para 50 ml com o wa fervidater. Guardar a solução hermeticamente fechado. Se parece precipitado, descartar e fazer um novo.
- Em três copos menores preparar quente, água recém-fervida deionizada. Lavar o acetato de uranilo, por imersão a grade no primeiro béquer e agitar suavemente-la em torno de 30 seg. Repita este passo nos outros dois copos.
- Abrir a parte superior da placa de Petri de vidro apenas o suficiente para colocar a grelha sobre a gota de solução de citrato de chumbo de Reynold. Se possível, use uma máscara ao fazer isto para evitar respirar em citrato de chumbo e para evitar a formação de precipitado. Incubar durante 10 min.
- Abrir a parte superior apenas o suficiente para remover a rede. Evite respirar no citrato de chumbo. Lave a rede três vezes por imersão sequencialmente em três copos com água morna, recentemente fervida destilada. Deixe que a grade seco sobre um pedaço de papel de filtro, a secção para cima. A amostra está pronta para o microscópio eletrônico.