Revestimentos de grafeno para implantes biomédicos

Resumo

Graphene oferece um potencial como um material de revestimento para implantes biomédicos. Neste estudo, demonstrar um método para ligas de revestimento de nitinol com camadas de grafeno nanômetro de espessura e determinar como o grafeno pode influenciar a resposta do implante.

Resumo

Grafeno atomicamente lisa como um revestimento de superfície tem um potencial para melhorar as propriedades dos implantes. Isto demonstra um método para revestimento de ligas de nitinol com camadas espessas de grafeno nanômetros para aplicações como material de stent. Graphene foi cultivada em substratos de cobre através da deposição química de vapor e, em seguida, transferido para o nitinol substratos. A fim de compreender como o revestimento de grafeno poderia alterar a resposta biológica, a viabilidade celular das células endoteliais da aorta de rato e aorta de rato nas células musculares lisas foi investigada. Além disso, o efeito de grafeno-revestimentos sobre a adesão celular e morfologia foi analisada por microscopia confocal com fluorescente. As células foram coradas para a actina e núcleos, e houve diferenças perceptíveis entre amostras puras de nitinol em comparação com grafeno amostras revestidas. Expressão da actina total a partir de ratos células do músculo liso da aorta foi encontrada utilizando Western blot. Características adsorção de proteínas, um indicador para trombogenicidade potencial, were determinado para o fibrinogénio e com albumina de soro de electroforese em gel. Além disso, a transferência de carga a partir de fibrinogénio ao substrato foi deduzida utilizando espectroscopia de Raman. Verificou-se que o revestimento de substratos de grafeno em nitinol preencheram os requisitos funcionais de um material de stent e melhorar a resposta biológica em comparação com o nitinol não revestido. Assim, o grafeno revestido nitinol é um candidato viável para um material do stent.

Introdução

As últimas três décadas têm testemunhado a descoberta de novos materiais baseados em terapias e dispositivos para tratamento de doenças e diagnósticos. Novos materiais de liga, tais como o nitinol (NiTi) e aço inoxidável são frequentemente utilizadas na fabricação de implantes biomédicos, devido às suas propriedades mecânicas superiores. ^1-3 No entanto, vários desafios permanecem devido à citotoxicidade de material exógeno, bio e hemo-compatibilidade. A natureza metálica destes resultados ligas pobres em bio-hemocompatibilidade e devido à lixiviação de metais pesados, à falta de adesão celular, proliferação e trombose quando entra em contacto com o sangue que flui (por exemplo, cateteres, enxertos de vasos sanguíneos, stents vasculares, válvulas cardíacas artificiais etc.). ^{1, 4, 5} A interacção de proteínas ou células vivas com a superfície do implante pode conduzir a uma forte resposta imunológica e a consequente cascata de reacções bioquímicas podem afectar negativamente a funcionalidade do dispositivo. Portanto, é pertinent para conseguir o controle sobre as interações entre os implantes biomédicos e seu ambiente circundante biológica. A modificação da superfície é frequentemente utilizado para reduzir ou evitar a resposta fisiológica adversa de origem a partir do material de implante. Uma superfície de revestimento ideal deverá ter a força de aderência elevada, inércia química, suavidade elevada e bom hemo-e biocompatibilidade. Anteriormente, vários materiais, incluindo carbono tipo diamante (DLC), SiC, TiN, TiO ₂ e muitos materiais poliméricos têm sido testados como bio-compatíveis revestimentos de superfície do implante. ^{1, 6-23} No entanto, estes materiais ainda são incapazes de atender a todos os critérios funcionais para um revestimento adequado do implante de superfície.

A descoberta do átomo espessa camada de carbono sp ^2, conhecido como o grafeno, abriu as portas para o desenvolvimento de novos materiais multifuncionais. Grafeno é esperado para ser um candidato ideal para o revestimento de superfície do implante, uma vez queé quimicamente inerte, atomicamente suave e altamente durável. Nesta Carta, vamos investigar a viabilidade de grafeno como um revestimento de superfície para implantes biomédicos. Os nossos estudos mostram que o nitinol grafeno revestido (Gr-NiTi) cumpre todos os critérios funcionais, e também suporta o músculo liso e excelente crescimento celular endotelial que conduz à proliferação celular melhor. Nós também achamos que a adsorção de albumina de soro na Gr-NiTi é maior do que fibrinogênio. É importante notar que (i) as nossas medições espectroscópicas detalhados confirmou a falta de transferência de carga entre o grafeno e fibrinogénio sugere que o revestimento grafeno inibe a activação de plaquetas por meio de implantes, (ii) revestimento de grafeno não exibem qualquer toxicidade significativa em testes in vitro sobre linhas endoteliais e musculares lisas celulares confirmando sua biocompatibilidade, e (iii) os revestimentos grafeno são quimicamente inerte, resistente e impermeável no fluxo sanguíneo ambiente. Estes hemo-e propriedades biocompatíveis, juntamente com st elevadorength inércia química e durabilidade, tornam revestimentos grafeno como um revestimento de superfície ideal.

Protocolo

1. Graphene revestimento de NiTi

1. As amostras de grafeno utilizados neste estudo foram cultivadas em cobre (Cu) substratos que utilizam a técnica de deposição química de vapor, e, posteriormente, transferidos para 4,5 mm ² substratos de NiTi.
2. Cu folhas (1 cm x 1 cm) foram colocadas num forno de tubo de 1 polegada de quartzo e aquecidos a 1000 ° C, na presença de 50 sccm de H ₂ e 450 sccm de Ar.
3. Metano, seguinte (1 e 4 sccm) foi introduzido na fornalha a taxas de fluxo diferentes para 20-30 min. As amostras foram finalmente arrefecida até à temperatura ambiente sob fluxo de H _2, Ar e CH _4.
4. Em seguida, as lâminas foram spin-Cu revestido com PMMA (diluído com anisol a 4%) a 4000 rpm, seguido por um tratamento pelo calor durante 5 minutos a 150 ° C. Graphene anexado a camada de PMMA foi obtida por decapagem da folha de Cu utilizando Transene Inc., CE-100 ácido, e subsequente lavagem com HCl a 10% e água desionizada durante 10 min.
5. A splos foram transferidas para substratos de NiTi (4,5 mm ²⁾ e recozida a 450 ° C em Ar (300 sccm) e H ₂ (700 sccm) durante 2 horas para remover o PMMA. Por fim, os substratos foram lavados com acetona, para dissolver o PMMA residual para obter a amostra de Gr-NiTi. A Dilor XY monocromador grating triplo foi usado para a caracterização de micro-Raman (utilizando objectivo 100X) de todos os NiTisamples Gr-excitação com a 514,5 nm de um laser de iões de Ar ^+.

2. Toxicidade In Vitro de Gr-NiTi

As células endoteliais da aorta de rato (Cell aplicação Inc.,) foram cultivadas em um revestimento de gelatina de slides câmaras 8. Para testar o crescimento celular, como novo e Gr-NiTisubstrates foram colocadas em poços sem qualquer revestimento de gelatina. As imagens de microscopia electrónica de digitalização foram obtidos utilizando um Hitachi S-4800 SEM. Além disso, o rato células musculares lisas da aorta foram também cultivadas em Cellbind placas de 96 poços, como um grupo de controlo (Corning) em DuModified lbecco de Eagle Médium (ATCC).

1. Para testar a viabilidade das células, as células (células do músculo liso e endoteliais ambos) foram semeadas a 10 ⁵ células / poço em poços contendo NiTi pristine, 1 sccm ou 4 sccm Gr-NiTi substratos, onde a sccm indicado corresponde ao fluxo de metano usada no DCV crescimento de grafeno. As células foram cultivadas durante o período de tempo desejado em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO _2, a troca de meio todos os outros dias.
2. No ponto de tempo final, o meio foi removido e meio fresco contendo 0,5 mg / ml de brometo de tetrazólio de azul de tiazolilo (MTT, ou obtidos a partir de Sigma) foram adicionados a cada poço. As células foram então incubadas durante mais 3 horas adicionais. Para o ensaio de MTS, o meio foi removido no ponto de tempo final, e substituído por 120 ul de solução de trabalho MTS (Cell aquoso 96 Tier, Promega) e incubado durante 3 h.
3. Em seguida, o meio foi suavemente removido e 100 ml de dimetilsulf óxido (Sigma) foi adicionado a cada poço. Após alloasa 10 min para os cristais de MTT para dissolver, a solução foi transferida para outro prato de poço. Para o ensaio de MTS, não dimetilsulfóxido foi adicionada aos poços. Conteúdo do poço foram transferidas para uma nova placa.
4. A absorvância foi lida a 490 nm e a viabilidade percentual foi determinada através da normalização da absorvância a absorvância média da amostra de NiTi intocada. Pelo menos, cinco repetições foram feitas para cada tipo de amostra.

3. Estudos de microscopia confocal da morfologia das células

1. Para imagem confocal de ratos células do músculo liso da aorta, os substratos foram colocados em uma corrediça 8-câmara (Thermo Scientific). As células foram semeadas a 25000 células / câmara e incubou-se durante 3 dias a 37 ° C e 5% CO _2.
2. As células foram fixadas no substrato com formaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato durante 20 minutos.
3. Permeabilizadas com 0,1% de Triton-X, durante 1 min.
4. Actina foi corado com Alexa Fluor 488 faloidina (LIFTecnologias e). 100 ul de alexafluor faloidina 488 a 200 unidades / ml de metanol foi adicionado a 1,9 ml de solução salina tamponada com fosfato. As células foram coradas com 250 ul de alexafluor faloidina 488 durante 45 minutos e depois lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato.
5. Os núcleos foram montados com Vectashield meio fluorescente de montagem contendo DAPI (Vector Laboratories). Imagens confocal foram coletados com uma Nikon Confocal TI. Uma câmara com células, sem qualquer substrato foi utilizado como controlo.

4. A adsorção da proteína Estudos

1. Dimensões de substratos foram medidos com compassos antes de iniciar os experimentos de adsorção de proteínas. Foram feitas três medições para cada um dos lados das amostras de aproximadamente quadradas, com uma média para obter o comprimento e largura.
2. Cada uma das amostras, como novo NiTi, e 1sccm 4sccm Gr-NiTiwere incubadas com 1 mg / ml de albumina em tampão fosfato salino (PBS) ou 1 mg / ml em PBS de fibrinogénio no quarto temperatura durante 3 hr.
3. Iguais amostras foram combinados num tubo de microcentrífuga com 200 jil de tampão de amostra de redução e fervida durante 5 min.
4. As amostras foram então diluídas em tampão Tris / glicina / SDS (Bio-Rad) e executado através de um gel de 4-15% de poliacrilamida de electroforese Tris (Bio-Rad) a 90 V durante 100 min.
5. Os géis foram corados com Vermelho Sypro. Diluir Sypro Red solução stock (Life Technologies) a 1:5.000 em ácido 7,5% v / v ácido acético. Stain géis durante 60 minutos.
6. Géis de imagem utilizando uma Flourchem SP (Alpha Innotech). Intensidade de fluorescência foi quantificada utilizando o software ImageJ. A intensidade de fluorescência de cada amostra foi normalizada pela área total do substrato e do fibrinogénio adsorvido em comparação com a adsorção de albumina.

5. Western Blotting para Protein Expression

1. Western blot foi realizada para analisar a actina total em ratos células do músculo liso da aorta. As células foram semeadas a 10000 células / substrato em um 96-wplaca ell.
2. As células foram cultivadas por três dias antes de retirar mídia. A proteína total foi extraída com tampão RIPA e um padrão de ensaio BCA (Lamda) foi realizada para quantificar a proteína total.
3. As amostras foram diluídas para a mesma concentração em RIPA e então fervidos em tampão de amostra de uma redução de 5 min.
4. As proteínas foram separadas por um gel de poliacrilamida a 4-15% Tris por electroforese a 90 V durante 100 min. Um caleidoscópio de proteína padrão (Bio-Rad) foi utilizada para avaliar o peso molecular da proteína.
5. As proteínas foram transferidas para uma membrana de PVDF e bloqueada com uma solução de 1% de matéria seca não gorda de leite (Bio-Rad).
6. Actina total foi marcado com um anticorpo de coelho anti-actina de rato (Sigma). A BM kit de quimioluminescência (Roche) foi utilizado para detectar o anticorpo primário. As membranas foram fotografadas usando FlourChem SP equipamento de imagiologia e intensidade de fluorescência foi medida utilizando o software ImageJ. A intensidade de fluorescência foi normalizado por comparação com o pristine NiTisample.

Resultados

. Figura 1 a) DCV grafeno policristalino cultivadas em folhas de Cu imita os grãos de metal de cristal (barra de escala: 10 mm). b) espectro Raman de 1 sccm (4 sccm) grafeno mostra monocamada intensa (relativamente mais fraca) G 'banda indicando (camada poucos) a natureza de como preparado grafeno. c) imagem de AFM grafeno transferidos para NiTi mostra uma rugosidade de aproximadamente 5 nm. Barra d...

Discussão

Biocompatibilidade e citotoxicidade: A deposição de vapor químico (CVD) método rendeu amostras policristalinas grafeno que imitavam grãos de cristal de Cu, como mostrado na Figura 1A. Nós empregamos espectroscopia Raman para confirmar a presença de monocamada de grafeno (camadas poucos) em 1 sccm (4 sccm) amostras (ver Figura 1b). Claramente, uma SCCM (4 sccm) amostras exibem faixa indicativa de monocamada intensa (relativamente mais fraca) G '(camada poucos) grafeno.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
			Reagente
Modified Eagle Médium da Dulbecco	ATCC	30-2002
Azul de tiazolilo tetrazólio	Sigma-Aldrich	M2128
CellTiter 96 Aqueous One solução ensaio de proliferação celular (MTS)	Promega	G3582
Dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich	D8418
36,5% de formaldeído	Sigma-Aldrich	F8775
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Alexafluor 488 faloidina	Life Technologies	A12379
Vectashield meio de montagem com DAPEu	Vector Laboratories	H-1200
Albumina de soro humano	Sigma-Aldrich	A9511
O fibrinogénio humano
Tris / glicina / SDS	Bio-Rad	161-0732
Pronto Gel Gel de Tris-HCl	Bio-Rad	161-1158
Ácido acético	Sigma-Aldrich	45726
Sypro Vermelho	Life Technologies	S-6653
Proteína ensaio BCA baixo	Lamda Biotech	G1003
Precision Plus Padrão Caleidoscópio Proteína	Bio-Rad	161-0375
Immun-Blot membrana PVDF	Bio-Rad	162-0177
Blotting grau bloqueador de leite seco não gordo	Bio-Rad	170-6404XTU
Anti-actina de anticorpos produzidos em coelho	Sigma-Aldrich	A2066
Quimioluminescência BM kit Western Blot (rato / coelho)	Roche Applied Science	11520709001
Tampão RIPA	Sigma-Aldrich	R0278
NiTi (51% Ni, Ti 49%)	Alfa-Aesar	44953
			Equipamento
Horiba JobinYvon	Raman espectrômetro	Dilor XY 98
Nikon	Microscópio confocal	Eclipse microscópio TI
Thermoscientific	Leitor de placa
Bio-Rad	Fonte de alimentação	164-5050	PowerPac alimentação básica
Bio-Rad	Célula de eletroforese	165-8004	Mini-PROTEAN célula tetra
Bio-Rad	Cassete titular gel	170-3931	Mini cassete titular gel