Um Método para High Fidelity Optogenetic Controle de Individual Piramidal neurônios In vivo

Resumo

O recente desenvolvimento de ferramentas de neurociência que combinam genética e óptica, denominado "optogenetics", possibilita o controle sobre a atividade do circuito neural com um nível sem precedentes de resolução espacial e temporal. Aqui nós fornecemos um protocolo para a integração na gravação vivo com manipulação optogenetic de subconjuntos geneticamente definidos de neurônios piramidais corticais pré-frontais e subicular.

Resumo

Métodos optogenetic surgiram como uma ferramenta poderosa para a elucidação atividade circuito neural subjacente a um conjunto diversificado de comportamentos através de uma ampla gama de espécies. Ferramentas optogenetic de origem microbiana consistem em proteínas de membrana sensível à luz que são capazes de ativar (por exemplo, canal-2, ChR2) ou o silêncio (por exemplo, halorodopsina, NpHR) atividade neural ingenetically definidos tipos de células em escalas de tempo comportamentalmente relevantes. Primeiro, demonstrar uma abordagem simples para entrega mediada por vírus adeno-associado de ChR2 e NpHR transgenes para o subiculum dorsal e região prelimbic do córtex pré-frontal em ratos. Porque ChR2 e NpHR são geneticamente targetable, descrevemos a utilização desta tecnologia para controlar a atividade elétrica de populações específicas de neurônios (ou seja, os neurônios piramidais) embutidos no tecido heterogêneo com alta precisão temporal. Descrevemos o hardware, software personalizadointerface do usuário e os procedimentos que permitem a entrega simultânea de luz e gravação elétrica de neurônios piramidais transduzidas em um anestesiado em preparação vivo. Estas ferramentas de luz responsivo proporcionar a oportunidade para identificar as contribuições causais de diferentes tipos de células para o processamento de informações e comportamento.

Introdução

A capacidade de ativar ou silenciar um tipo específico de célula dentro de um circuito neural de uma forma temporalmente preciso é fundamental para a compreensão de como os circuitos neurais processar diferentes tipos de informação subjacentes emoção e cognição. Controle experimental sobre a atividade neural intacto empregou ferramentas loss-/gain-of-function (por exemplo, estimulação elétrica, modulação farmacológica, lesão) que não fornecem o necessário para controlar seletivamente populações específicas de neurônios, ou em uma escala temporal ou espacial. Lidar diretamente com esses desafios tecnológicos, o desenvolvimento e aplicação de ferramentas sensíveis à luz geneticamente encodable permitiu neurocientistas para controlar a atividade elétrica dos tipos de células selecionadas durante os eventos comportamentais bem definidas. Muitas destas proteínas sensíveis à luz são de origem microbiana, com o canal de luz fechado catião, channelrodopsina-2 (ChR2) ^1, e a bomba de cloreto de luz dirigido, halorhodoppecado (NpHR) ^2,3, em uso generalizado.

Uma grande vantagem do Optogenetics é a capacidade das populações de células geneticamente-alvo específicos nas regiões do cérebro heterogéneos e a técnica tem sido aplicada com sucesso a um número de organismos modelo (invertebrados para primatas não-humanos) ^4-6. Muitos animais transgénicos optogenetic foram gerados e estão comercialmente disponíveis a ^7,8, no entanto, que estabelece linhas transgénicas podem ser de trabalho intensivo e custo proibitivo. Aqui nós descrevemos um protocolo para a entrega de forma viral mediada de genes ChR2 e NpHR sob o promotor CaMKIIα em ratos prelimbic córtex e subiculum dorsal usando um adeno-associado recombinante do vírus (AAV). Dentro do cérebro anterior, expressão CaMKIIα é exclusivo para os neurônios piramidais glutamatérgicos ^9. AAV é comumente utilizado para a pesquisa de base devido à sua relativa facilidade de produção e a falta de patogenicidade, assim como o forte e persia expressão do transgene do stent que tem sido conseguido com estes vectores de ^10. Além disso, delineamos os passos e hardware para entrega luz e gravação simultânea em ratos fixo-cabeça anestesiados.

Protocolo

1. Vírus Armazenamento e Preparação

1. O uso de vetores de AAV incompetente de replicação para a entrega de genes opsina para roedor cérebro é aprovado para Biossegurança Nível 1 (BSL-1) e exige uma protecção adequada e procedimentos de manuseio, conforme descrito na publicação governo dos EUA, Biossegurança em Laboratórios de Microbiologia e Biomédicas, disponível em os Centros de Controle de Doenças do site em ( http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm ).
2. A fim de evitar os ciclos de congelamento e descongelamento repetidos, vírus pipeta de frasco do fabricante em menores alíquotas de trabalho em uma Classe II Biossegurança Gabinete e armazenar em um freezer -80 ° C.
3. Antes da injeção estereotáxica, permitir uma alíquota para descongelar em gelo e, em seguida, girar rapidamente para baixo com uma centrífuga de bancada.
4. Lentamente aterrar uma seringa Hamilton e uma agulha de vidro com uma pequena quantidade de óleo mineral ou de silicone.Certifique-se de que não há bolhas de ar visíveis no corpo da seringa. Insira a seringa uma bomba microinjetor e anexar a bomba diretamente para o braço estereotáxico vertical (ie manipulador estereotáxica).
5. Abaixar o braço estereotáxico até que a ponta da agulha atinge a parte inferior do tubo alíquota do vírus. Usar o controlador para a bomba de microinjector para retirar o volume desejado de vírus (1,5 ul de uma injecção de 1 uL).
6. Todo o material e as superfícies que entram em contato com o vírus devem ser descontaminados com um desinfectante, como água sanitária (10%).

2. Cirurgia e Vírus Injeção

1. Anestesiar animais com uma mistura de cetamina (rato, e 125 mg / kg, ip) - xilazina (rato, 10 mg / kg, ip) coquetel. Para avaliar a eficácia da anestesia, verificar a existência de uma resposta reflexa a uma pitada dedo do pé e dar doses suplementares de cetamina, se necessário. Usando métodos cirúrgicos assépticas padrão, coloque animais em um aparelho estereotáxico (David Kopf Emtrumentos).
2. Fazer uma incisão na linha média através da pele na parte superior do crânio dos animais com pequenas tesouras cirúrgicas ou bisturi. Delicadamente separar tecido conjuntivo e limpar a parte superior do crânio com uma pequena espátula de osso.
3. Verifique se a cabeça do animal é o nível tal que o z coordenadas para bregma e lambda são iguais. Determinar as coordenadas estereotáxica para a área do cérebro o alvo de um atlas do cérebro, como o cérebro de um rato em estereotáxica Coordenadas (George Paxinos e Charles Watson, Academic Press, 2007) ou The Mouse Cérebro em estereotáxica Coordenadas (Keith BJ Franklin e George Paxinos, Academic Press , 2007). Marque o local pretendido de injeção com uma caneta cirúrgica.
4. Cuidadosamente fina do crânio sobre a área do alvo usando uma broca de mão e parar quando a broca atinge a parte inferior do crânio. Utilizando um par de pinças extra fino, remover o osso diluído a fim de expor a dura.
5. Posicione a agulha da seringa sobre o alvo sãoum e abaixe a agulha até que ela toque a dura-máter e usar esse ponto para calcular a coordenada z. Reduzir-se muito lentamente a agulha de injecção para dentro do cérebro até a posição correcta z é atingido. Neste protocolo, a região prelimbic do córtex pré-frontal medial (2,7 mm anterior a bregma, ± 0,5 mm lateral à linha média, e -2,2 mm da dura) ou o subiculum dorsal (-6,0 mm anterior ao bregma, ± 3,0 mm lateral com a linha média, e -2,0 mm da dura) é alvo de um adulto masculino Sprague Dawley (aprox. 275 g).
6. Injectar o vírus, a uma taxa de 0,1 mL / min. Após a injecção está terminada esperar 10 minutos antes de se retirar a agulha a fim de evitar o refluxo do vírus à superfície do cérebro.
7. Use uma sutura de costura com agulha para selar a pele e aplicar antibióticos para a ferida.
8. O curso do tempo da expressão funcional ChR2 e NpHR de vectores de AAV podem variar, dependendo do desenho experimental e título viral. Para esta experiência, in vivo gravações foram realizadas 18-21 dias após a injecção.

3. Entrega Luz e de Gravação vivo de ChR2 ou NpHR-expressando neurônios

1. Anexar um eletrodo de tungstênio (~ 1-1,5 mohms, microprobes) a um tubo capilar de vidro (Fisher Scientific) com super-cola.
2. Use uma ferramenta de fibra de descascamento (Thorlabs) para expor a extremidade nua de uma fibra multimodo óptico (200 núcleo um de diâmetro, Thorlabs) e ponta de fibra limpa com etanol. Muito levemente marcar ponta de fibra com uma faca de diamante em forma de cunha (Thorlabs) e remova cuidadosamente o excesso de fibras (por exemplo, com uma pinça fina). A fibra deve decompor facilmente no placar.
3. Ligue o FC extremidade da fibra para o conector de PC na porta de um único laser de díodo 200 mW (saída www.Lumiphy.com ) com o comprimento de onda desejado. Certifique-se de que óculos de proteção apropriado é usado em todos os momentos em que o trabalho com lasers.
4. Meça a lintensidade aser na ponta da fibra óptica utilizando um medidor de potência óptica ( www.Lumiphy.com ). Para in vivo gravações, a intensidade da luz tão pouco quanto 20-100 mW / mm ² pode evocar confiavelmente ChR2-ou activação ou silenciamento NpHR-mediada, respectivamente, da actividade neuronal.
5. Inserir a fibra óptica no interior do tubo capilar. Posicione a ponta da fibra de aproximadamente 500 mm acima da ponta do eletrodo de tungstênio e amarrar um fio de sutura fina duas vezes em alguns pontos perto da ponta para que o eletrodo ea fibra são retas. Certifique-se de que a distância entre a ponta do eléctrodo e do nó mais próximo é o tempo suficiente para a inserção da região alvo.
6. Prepare o animal tal como nos passos 2.1 e 2.2 acima. Use a craniotomia inicial como um guia para fazer uma nova janela pequena limpo no crânio para o posicionamento do optrode ( www.Lumiphy.com ). Fazer uma pequena incisão na parte dura usando uma agulha fina.
7. Cuidadosamente abaixe o optrode através da janela do crânio e no cérebro para a região transduzidas usando um micromanipulador (Narishige). Em seguida, avançar o optrode lentamente em 10-50 mM passos até o surgimento de uma célula de luz responsivo.
8. A interface de usuário do software personalizado (NeuroLux Pro www.Lumiphy.com ) escrito em LabVIEW (National Instruments) é usado para controlar o laser de diodo única e para visualizar e gravar a atividade neural em curso. Sinais gravados são capturados com um Examp-20K (Kation Científica) amplificador passa-banda-filtrada (0,3-8 kHz), e um análogo da National Instruments para lousa digital (NI USB-6009). A interface de usuário NeuroLux Pro permite a escolha de entradas analógicas (escolher dois canais para o sinal neuronal e TTL) e saída digital. O usuário pode definir a taxa de amostragem (20 kHz), o período de linha de base (pré-light), e pós-luz. O usuário pode definir o stimulati a laser TTLem largura de pulso, freqüência e período de estimulação (se a freqüência é de 20 Hz e estimulação período é de 500 ms, 10 pulsos de laser com largura de pulso definida são entregues). O usuário também pode escolher a entrega de luz contínua (por exemplo, Figura 1). Para gravações repetidas, o usuário também pode definir o número de trens de pulsos eo intervalo entre trens. Os dados podem ser adquiridos com ou sem gravação em disco.
9. Após a gravação, os animais são anestesiados com o cocktail de cetamina / xilazina e perfundidos transcardialmente com soro fisiológico e paraformaldeído (4%), a fim de verificar a colocação optrode e expressão de opsina.

Resultados

A Figura 1 mostra uma imagem do software personalizado (NeuroLux Pro) desenvolvido em ambiente LabVIEW (National Instruments) utilizada para gravação simultânea de atividade neuronal e controlar parâmetros de pulso de luz (ou seja, frequência de pulso, largura de pulso, período de estimulação). O programa de software envia um sinal de comando para um dispositivo de aquisição digital que gera pulsos TTL para o controle sobre o laser de diodo único. Além disso, os softwares programa exibe e armazena a atividade neuronal gravado e sinais TTL entregues. Estes sinais são digitalizados por meio do dispositivo de aquisição de uma taxa de amostragem definida (por exemplo, de 20 kHz). Sinais gravados são guardados como um array bidimensional de precisão dupla em um arquivo binário.

A Figura 2 mostra o optrode costume consistindo de um eléctrodo de tungsténio ligado a uma fibra óptica. Uma fibra óptica é fixado ao eléctrodo utilizando fio de sutura fina em trêspontos. Se necessário, super-cola pode ser utilizada para colar a eles. No entanto, evitar que fixa permanentemente a fibra óptica para o eléctrodo porque, embora o eléctrodo pode ser reutilizado várias vezes, a transmissão de luz através da fibra se degrada com o uso repetido e deve ser clivado e limpo ou substituído com cada inserção no cérebro.

Painéis esquerdo da Figura 3 mostra imagens fluorescentes de uma maior proteína fluorescente amarela, indicando ChR2 real e expressão NpHR. Estas fotografias mostram a expressão NpHR representante no rato subículo dorsal (Figura 3A) e de expressão em ChR2 prelimbic córtex (Figura 3B). Viral expressão era restrita principalmente ao subiculum dorsal e córtex prelimbic (por exemplo, alguns fluorescência foi observada no giro denteado (Figura 3A, à esquerda)). Também foram observadas as faixas do eletrodo (faixa fina, cabeça de seta) e fibra óptica (faixa de espessura, seta).

Figura 4 mostra que ChR2 induzida spiking temporalmente preciso no córtex de rato prelimbic. Figura 4A é um exemplo de rastreio de potenciais de acção ChR2-desencadeada em resposta a 20 Hz de entrega de 10 mseg pulsos de luz azul para rato prelimbic córtex. Raster trama (Figura 4B) mostra a activação induzida por ChR2 em seis neurónios representativos. Todos os neurônios registrados mostrou spiking luz evocadas com fidelidade perfeita. Em contraste com ChR2, NpHR rapidamente e reversivelmente silenciados actividade espontânea in vivo em ratos prelimbic córtex (painel da direita da Figura 4). Figura 4C é um exemplo de rastreio mostrando que contínua iluminação de 532 nm (10 s) do córtex prelimbic expressar sob o NpHR CaMKllα promotor elimina atividade de uma única unidade espontânea in vivo. Note-se que o silenciamento completa da actividade das células piramidais prelimbic é para a entrega de luz contínua 10 seg tempo bloqueado. Baixoer raster plot (Figura 4D) mostra silenciamento induzido por NpHR em seis neurônios representativos. Tanto in vivo gravações são típicos, obtidos a partir de ratos adultos Sprague-Dawley em que a entrega mediada por AAV de genes microbianos opsina ocorreu entre 18-21 dias antes.

A Figura 5 mostra o resultado da estimulação repetida ChR2 de um neurónio piramidal prelimbic rato. Azul pulso de luz (10 ms) foi entregue a 20 Hz por 5 segundos (total 100 pulsos). Vestígios de tensão da spiking luz evocadas foram repetidamente adquirido a cada 2 minutos durante uma sessão de gravação de 2 horas (61 repetições no total). Mesmo quando se usa este protocolo de estimulação repetitiva, ChR2 induzida spiking estável e robusto, em resposta ao fornecimento de luz.

Figuras 6 e 7 mostram os resultados da fotoinibição induzida por NpHR e fotoativação ChR2-driven de rato subicular atividade dos neurônios. Como é o caso no córtex prelimbic, NpHR e ChR2 puderammediar o tempo bloqueado inibição induzida por luz e ativação dos neurônios subicular transduzidas-opsina com alta reprodutibilidade.

Figura 1. Captura de tela da interface do software Pro NeuroLux para entrega luz e gravação simultânea eletrofisiológico. Traço Na foto mostra silenciamento NpHR induzida da atividade espontânea de ratos células piramidais prelimbic em resposta a 10 seg de contínua entrega 532 nm de luz. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2. Imagem de alta potência de optrode personalizado. Uma fibra óptica está inserido no interior do tubo capilar de vidro, ligado a um eléctrodo de tungsténio e fixada ao eléctrodo utilizando fio de sutura. A distância de centro a centro de entreen a ponta do eletrodo ea ponta da fibra é de aproximadamente 500 mm.

Figura 3. Expressão viral e colocação optrode. (Esquerda) As fotografias mostram expressão NpHR representante no subiculum dorsal (A) e de expressão ChR2 no córtex prelimbic (B). (Direita) esquemático que representa o local onde cada fotografia foi tirada. A seta e flecha em cada fotografia indicam a localização do eletrodo de tungstênio e de fibra óptica, respectivamente. SUB: subiculum, DG: giro denteado, PL:. Córtex prelimbic Clique aqui para ver maior figura .

Figura 4. In vivo registros eletrofisiológicos de ChR2 ou NpHR-transduzidas prelimb ratoic córtex. (A) Exemplo traço de potenciais de ação ChR2-desencadeadas em resposta a 20 Hz entrega de azul (473 nm) pulsos de luz (10 ms, azul bar). (B) Raster enredo mostrando spiking induzida por ChR2 em seis neurônios representativos. Cada unidade de actividade é representada como um ponto. (C) Exemplo traço de supressão induzida por NpHR da atividade espontânea durante verde contínua (532 nm) iluminação de luz (10 seg, bar verde). (D) Raster enredo mostrando silenciamento induzido por NpHR em seis neurônios representativos. Cada atividade unidade é plotado como um ponto. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 5. Spiking Repetitivos 20 Hz ChR2-driven de um neurônio piramidal prelimbic rato in vivo. (A) Tensão traços do spiking luz evocadasadquirido nos pontos de tempo 0, 30, 60, 90, 120 minutos depois do início da gravação. (B) Raster enredo mostrando todos os 61 repetições (2 min de intervalo inter-julgamento, 120 min total) da ativação induzida pela luz. Cada atividade unidade é plotado como um ponto. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 6. In vivo registros eletrofisiológicos de NpHR-transduzidas subiculum dorsal de ratos. (A) Exemplo traço contínuo mostrando que a iluminação de 10 seg 532 nm (barra verde) do subiculum dorsal expressar NpHR elimina atividade espontânea. (B) formas de onda média das duas unidades gravado a partir do traço acima. O limiar de amplitude foi utilizado para a identificação de dois neurónios distintas. (C) Raster trama mostra cinco repetiçãos de silenciamento induzido por NpHR destas unidades. Cada unidade de actividade é representada como um ponto.

Figura 7. Repetitivo 20 Hz-driven CR2 spiking de um rato dorsal subicular neurônio in vivo. (A) Tensão vestígios da luz evocadas spiking adquiridos nos pontos de tempo 0, 30, 60, 90, 120 minutos depois do início da gravação. Detalhe: a atividade estouro típico desta célula. (B) Raster enredo mostrando todos os 61 repetições (2 min de intervalo inter-julgamento, 120 min total) da ativação induzida pela luz. Cada atividade unidade é plotado como um ponto. Clique aqui para ver maior figura .

Discussão

Uma grande variedade de técnicas estão disponíveis para geneticamente visando genes microbianos opsina para regiões cerebrais distintas em roedores. Entrega do gene viral fornece uma abordagem relativamente barata e rápida para mediar ChR2 e NpHR expressão com o tipo de célula especificidade. Os sistemas de vector de AAV são uma opção comum para utilização em experiências optogenetic devido a títulos elevados de produção que se mantêm estáveis ​​durante o armazenamento, a sua falta de patogenicidade, e a sua capacidade para produzir a expressão do gene de longo prazo ^10. Muitas das construções de opsina com promotores específicos do tipo de células estão comercialmente disponíveis numa variedade de serotipos de AAV a partir de instalações nucleares, tais como o vector da Universidade da Pensilvânia ( http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore ) ou a University da Carolina do Norte em Chapel Hill ( http://genetherapy.unc.edu ). Uma desvantagem para a tecnologia de AAV é ocapacidade limitada de embalagens (~ 4,7 kb), que coloca uma restrição no tamanho da cassete de transgene que pode ser utilizado para direccionamento de células específicas. Como uma alternativa, os vectores lentivirais, que têm uma capacidade de embalagem maiores, é capaz de acomodar opsina alvo sob o controlo de sequências promotoras de maiores dimensões.

O uso de um optrode permite a detecção segura de sinais electrofisiológicos em combinação com o fornecimento de luz temporalmente preciso. Como descrito acima, no entanto, é necessário o cuidado suficiente na sua construção. Uma vez que a fibra tica clivada é frágil, que amarra o fio de sutura pode causar muita força para quebrar a fibra. Mesmo que o optrode pode ser usado para várias gravações, o eléctrodo e de fibra óptica deve ser limpa (ou manualmente clivada no caso de a extremidade nua da fibra óptica), antes da inserção, porque a impedância do eléctrodo e da qualidade da luz entregue degradará com o uso repetido.

Durante elementogravações ctrophysiological é importante que o optrode ser avançada lentamente. O optrode usada aqui tem aproximadamente 350 espessura mM (eletrodo de tungstênio: 125 m; núcleo da fibra óptica: 200 mm) e baixá-lo rapidamente pode levar ao movimento do tecido cerebral. Artefatos induzidos-Light também pode ser considerada com particular gravação e entrega luz set-ups ^11-12. Embora não tenhamos encontrado nenhum artefato induzida pela luz em nossa condição experimental, as gravações fora da área do cérebro transdução pode, potencialmente, ser usado como um controle de artefatos leves. Outra consideração durante o processo de gravação é a intensidade da luz necessária para a observação de alterações na CHR2-ou NpHR-expressam os neurónios, em especial para as gravações de longa duração. Intensidade do laser forte e iluminação do laser a longo poderia resultar no prejuízo dos tecidos e / ou uma diminuição da resposta ao subsequente de luz entregue ^12-13. Para experimentação comportamental é necessária a utilização de um vector viral de controlo para eliminating de qualquer efeito devido ao calor produzido a partir da fibra. Para muitas das construções optogenetic disponíveis comercialmente há construções complementares de controle, em que a sequência do gene da opsina foi removido.

Deve notar-se que a engenharia ChR2 variantes com propriedades melhoradas e cinética têm sido desenvolvidos ao longo com outros opsinas silenciamento que podem ser mais adequados para certas questões experimentais ^14-15. Por exemplo, uma nova variante ChR2 estabelecida através de mutagénese direccionada, denominado "Cheta", pode dirigir-alta fidelidade spiking neuronal em frequências (até pelo menos 200 Hz) acima daquela da ChR2 ¹⁴ original.

A combinação de in vivo entrega luz e gravação simultânea de respostas neuronais é um passo crítico no estabelecimento de relações de causalidade entre a atividade estampados nas populações de células geneticamente direcionados e eventos comportamentais bloqueado em tempo correspondentes. Os procedimentos e hardware descrito aqui fornecer uma abordagem simples para a implementação optogenetics para in vivo gravações fixo-cabeça em roedores.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa	Hamilton	7653-01	10 μ l
Agulha removível	Hamilton	7803-03	calibre 31, ponta chanfrada
Bomba Microinjetora	World Precision Instruments	UMP3
Controlador de Bomba	Precision Instruments	SYS-MICRO4
Óleo de Silicone	Alfa Aesar	A12728
Laser Eyeware Protetor	Kentek	KMT-4501
Fibra óptica multimodo	Thorlabs	BFL37-200	200 μ m de diâmetro, 0.37 NA
Ferramenta de Decapagem de Fibra	Thorlabs	T12S21	para 200 μ Medidor de potência óptica de fibra multimodo com núcleo de diâmetro m
	Lumiphy LLC	www.lumiphy.com
Fotodetector	Newport	818-SL/DB
Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW)	Lumiphy LLC	www.lumiphy.com	acoplado a um 200 μ m fibra multimodo com adaptador FC/PC
Laser Verde (532 nm, 100-200 mW)	Lumiphy LLC	www.lumiphy.com	acoplado a um 200 μ m fibra multimodo com adaptador FC/PC
Tungstênio/Fibra Optrode	Lumiphy LLC	www.lumiphy.com	Lumitrode
Tubo Capilar de Vidro	Fisher Scientific	22-362-566
Micromanipulador Hidráulico	Narishige	MO-22
Amplificador	Kation Scientific	Dispositivo de Aquisição de Dados ExAmp-20K
	National Instruments	NI USB-6009
Apoio de Cabeça para Roedores para Gravação	Lumiphy LLC	www.lumiphy.com
Small Animal Unidade Estereotáxica	de Instrumentos David Kopf	Modelo 963