Determinação do esvaziamento gástrico com um não-invasivo [ 13 C]-octanóico teste de respiração ácido para gastroparesia rastreamento em camundongos NOD fêmeas LTJ.
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Artigo de método
Estudo do esvaziamento gástrico em ratos diabéticos não obesos utilizando a [
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Resumo
Resumo
Estudos de esvaziamento gástrico em ratos têm sido limitadas pela incapacidade para acompanhar alterações gástricas esvaziamento no mesmo animal uma vez que as técnicas mais vulgarmente utilizados necessitam de matar os animais e recuperação pós-morte de 1,2 a refeição. Esta abordagem evita a estudos longitudinais para determinar alterações no esvaziamento gástrico com a idade e progressão da doença. A comummente utilizados [13 C]-octanóico teste de respiração para os seres humanos ácido 3 foi modificado para utilização em ratinhos e ratos 4-6 e 7 que anteriormente mostraram que este teste é de confiança e sensível às mudanças no esvaziamento gástrico em resposta a drogas e durante progressão da doença diabética 8. Neste vídeo de apresentação do princípio e aplicação prática deste teste modificado é explicado. Como no estudo anterior, os ratinhos NOD LTJ são usados, um modelo de diabetes do tipo 1 9. A proporção destes ratos desenvolvem os sintomas de gastroparesia, uma complicação da diabetes caracterizadas por esvaziamento gástrico retardado, sem obstrução mecânica do estômago 10.
Este artigo demonstra como treinar os ratos para testes, como preparar a refeição de teste e obter 4 hr gástricas dados esvaziamento e como analisar os dados obtidos. O analisador de isótopo de carbono utilizado no presente estudo, é adequado para a amostragem automatizada de amostras de ar de até 12 ratinhos, ao mesmo tempo. Esta técnica permite o acompanhamento longitudinal de esvaziamento gástrico a partir de grupos maiores de ratos com diabetes ou outras doenças de longa duração.
Introdução
Este manuscrito descreve as considerações técnicas e metodológicas envolvidas na medição não invasiva do esvaziamento gástrico em ratos. Seguindo o protocolo descrito aqui, os investigadores podem de forma fiável e reproduzível acompanhar as alterações no esvaziamento gástrico, devido ao desenvolvimento de uma doença, estudar o impacto dos agentes farmacológicos sobre o esvaziamento gástrico e seguir a resposta de esvaziamento gástrico para o tratamento de doenças subjacentes ou defeitos 6,8, 11,12. Em publicações anteriores, a aplicação de 13 C do ácido octanóico testes de respiração mostrou ser uma forma útil de medir o esvaziamento gástrico nos seres humanos e animais 3,8. Este trabalho descreve, em detalhe, os procedimentos necessários para obter dados fidedignos sobre a 8 6 para meses necessários para um estudo longitudinal de esvaziamento gástrico em ratos com diabetes. As vantagens de seguir este protocolo, quando comparada com os métodos anteriormente publicados são de que o investigador pode ser assegurado o obtaine dadosd será confiável e reprodutível. Além disso, o sistema automático de recolha e análise de amostras de gás aqui descrita aumenta o número de animais que podem ser seguidos simultaneamente em estudo. No geral, o objetivo deste trabalho é identificar os principais fatores que mantêm a habituação dos ratos para o teste e que reduzir a variabilidade nos resultados obtidos.
Para a medição in vivo de esvaziamento gástrico, os ratos são alimentados durante a noite e colocados nas câmaras de ensaio de plástico transparente, com fluxo de ar constante. Depois de os ratos ficam habituados aos tubos, de linha de base exalado 13 níveis de CO 2 são determinadas e o fluxo de ar ajustado de acordo. Em seguida, administrar uma refeição de teste consistindo em gema de ovo misturado com 13 C-rotulado ácido octanóico. Porque os ratos são jejuou e treinados, eles geralmente comem a refeição de teste dentro de 2 min. A administração de ácido octanóico não é absorvido no estômago, mas será retomado no duodeno umd vai ficar metabolizada no fígado em 13 CO 2, o qual é libertado e expirado, resultando num enriquecimento de 13 CO 2 no ar circundante. As amostras de ar são recolhidos em intervalos de tempo determinados e são analisados pelo analisador de isótopo de carbono. O passo limitante da velocidade, em todo este processo é o esvaziamento gástrico e a excreção pulmonar de 13 CO 2 corresponde directamente com o esvaziamento gástrico da refeição rotulados.
Figura 1. Esquemática do aparelho de esvaziamento gástrico. Após jejum, os ratos são colocados em câmaras transparentes, permitindo-lhes mover e girar livremente. Um tubo de entrada permite que o influxo de ar fresco e constante e uma saída conduz ao analisador de isótopo para medir a 13 C a 12C em relação a respiração exalada. A câmara também tem uma porta central para fornecimento de alimentos contendo [13 C]-ácido octanóico.
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Protocolo
1. Treinamento e habituação dos Ratos
- Antes da análise, colocar todos os ratos em câmaras de teste de 2-4 horas, com o fluxo de ar constante, a fim de se habituam-as às condições de teste. Isso reduz acentuadamente a níveis de tensão que de outra forma poderiam causar detecção aberrante de esvaziamento gástrico retardado. Tratar os ratinhos do mesmo modo que se a experiência do esvaziamento gástrico foi executado. Prepare gema de ovo (ver mais adiante) sem adição de ácido octanóico e alimentar 0,2 g a cada rato.
- Repita esse processo até que os ratos são suficientemente treinados (tipicamente 2-3 vezes). Os ratos tipicamente são facilmente habituados, desde que as condições ambientais são mantidos os mesmos.
Nota: Não habituados ratos continuam a se mover em torno de cerca de 1 hora após a transferência para a câmara, e defecar e urinar com frequência, enquanto os ratos habituados rapidamente resolver em seu novo ambiente e descansar tranquilamente.
Nãote: Durante o experimento: os animais monitorar os sinais de perda de habituação, como urinar em excesso, a defecação, a falta de interesse em comer o ovo. Se este for o caso, considerar re habituating em uma câmara vazia 1-2 vezes antes de obter os dados de esvaziamento gástrico. A consistência é extremamente importante ao fazer esta experiência. Fazer as coisas exatamente da mesma maneira todas as vezes é a única maneira de obter resultados confiáveis e reprodutíveis. Isto inclui fornecer o tratamento (por exemplo, insulina), a cada dia, ao mesmo tempo, não separar os ratos dos seus companheiros de gaiola, a menos que seja absolutamente necessário, os ratos em jejum e de iniciar o teste o esvaziamento gástrico ao mesmo tempo, e manipulação dos ratos da mesma maneira.
2. Preparação do Isotope contendo farinha de Teste
- Comece com pesar 5 g de gema de ovo em um tubo falcon 50 ml. Repita essas etapas cada dia experimental para preparar uma refeição de teste fresco.
- Adicionar 10 ul de ácido octanóico com um Concentrção de 2 ul / g para o tubo de 50 ml Falcon contendo o ovo e misturar vigorosamente durante 1 min, com uma espátula no tubo falcon.
- O ovo é então transferido para um béquer de vidro e aqueceu-se ao longo de um bico de Bunsen até que coagula e a sua consistência é adequado para fazer pequenas bolas. Isso normalmente leva cerca de 30 segundos.
Nota: As bolas de gema de ovo deve pesar 0,2 g por mouse. Isto é importante para manter a dose cumulativa constante em todos os ratos.
3. Do início do experimento
- Uma vez treinados e prontos para o esvaziamento gástrico rápido, os ratos durante a noite (12 horas) em um metal "malha inferior" rack jejum para evitar coprofagia. Certifique-se de que eles têm livre acesso à água potável. Uma vez que são utilizados ratos diabéticos na experiência actual, eles não devem ser sujeitos a jejum durante mais de 16 horas.
- Comece definindo-se as câmaras de esvaziamento gástrico. Use câmaras limpas e tampas que tenham sido secos ao ar. Além disso, qualquertubos que ligam as câmaras para o analisador de CO ou o fornecimento de ar 2 deve estar isenta de humidade, a água pode interferir com o sinal lido pelo analisador
- Conectar as câmaras para os tubos de entrada que proporcionam um fluxo de ar constante. Em seguida, ligar os tubos de saída das câmaras para a máquina. Fechar os tubos e ligar o fluxo de ar.
Nota: aplicar uma pequena quantidade de vaselina no final das tampas de cobertura assim que se fecham de forma fácil e estão firmemente selado. Esta vedação é necessário recolher todo o dióxido de carbono produzido pelos ratos.
4. Procedimentos Experimentais
- Comece por pesagem de cada rato. O peso corporal é uma medida da sua saúde continuada bom. Em seguida, coloque cada rato na câmara apropriada. É claro que é importante que o ar que flui para dentro das câmaras no momento.
- Para iniciar a medição, permitir que os ratos para se aclimatar para as câmaras antes de ajustarção dos níveis de ar.
- Uma vez que os ratos aparecem calma, o que pode demorar alguns minutos, ajustar a taxa de fluxo de ar para cada câmara de mouse. Isto pode ser diferente para cada rato. Tipicamente, o fluxo de ar é ajustada no início da experiência para se certificar de que o CO 2 exalado atinge níveis detectáveis por qualquer que seja o equipamento está a ser utilizado, e para certificar-se de que o nível permanece suficientemente baixa para garantir a circulação de ar saudável. Usamos iniciais níveis de CO 2 entre 1.000 e 1.500 partes por milhão.
- Se ter dificuldade com os ajustes, verificar se há vazamentos de ar. Em seguida, repita o processo para cada uma das câmaras e prestar atenção para uma nova rodada de medidas para ver se os ajustes feitos ao fluxo de ar ter corrigido o nível de CO 2. É importante para se obter uma linha de base estável da leitura antes da alimentação dos animais. Nós usamos uma máquina com um recurso de auto-calibração. Se este não é o caso de calibração deve ser verificada.
- Quando isto for conseguido, administrar a refeição ovopara o primeiro registo do tempo e do rato a cada rato recebe os alimentos.
- Corremos o procedimento para 4 horas para obtenção de valores suficientes para a montagem da curva 13 CO 2 para o enriquecimento de cada rato. Confira os ratos a cada 30-60 minutos para se certificar de que os níveis de CO 2 são ainda seguros para os ratos.
- Preparar novas caixas contendo o alimento antes do final do teste, de modo que os ratos podem começar a comer imediatamente após o teste terminou.
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Resultados
Um conjunto de dados representativos a partir de três ratinhos diferentes é mostrada na Figura 2. O gráfico preto representa os pontos de dados de um rato, com o esvaziamento gástrico normal. Ela mostra a fracção de 13 C, que é recuperado no ar exalado, expressa em percentagem da dose administrada por hora expresso como uma função do tempo. A curva azul é a partir de um ratinho com um esvaziamento gástrico acelerado com um valor de meia T de 40 minutos e a curva de vermelho é de um rato com u...
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Discussão
A técnica aqui descrita permite uma repetida e não-invasiva de medição in vivo de esvaziamento gástrico em ratos sólido. Este sistema tem a vantagem de que os animais não são retidos na câmara de medição, o que lhes permite mover-se e girar livremente. Uma vez que este é um ambiente desconhecido, os ratos ainda precisam ser treinados e habituados às câmaras de testes para evitar efeitos do estresse sobre o esvaziamento gástrico. De um modo geral, nós assumimos os dados de esvaziamento gástrico são fiáv...
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.
Agradecimentos
Esta publicação vídeo foi possível graças ao financiamento do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (NIDDK) para o Projeto Programa de Grant "Patobiologia do Sistema Entérico" DK 68055. Christopher T. Creedon foi apoiado pelo Programa de Mentoria Rochester Escolas Públicas.
Agradecemos o Sr. Gary Stoltz para assistência técnica, a Sra. Kristy Zodrow para secretariado assistência e Douglas Dr. Baer, de Los Gatos Research, Inc (Mountain View, CA).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| NOME | EMPRESA | NÚMERO CAT | COMENTÁRIOS |
| Uma fonte de fornecimento constante de ar de fluxo, bem como a composição | central de fornecimento de ar na unidade de pesquisa | ||
| 130 ml câmara de amostragem que tem ar de entrada, de saída de ar, e abertura de administração de alimentos Tubos de plástico para o fornecimento de ar | Na casa construída | ||
| Octanóico | Cambridge Isotope Laboratories (Andover, MA) | CLM-293-1 | |
Para preparar a refeição de ovos:
| Qualquer fornecedor | Tenteser compatível com o fornecedor de ovos desde que o teor nutritivo e palatabilidade dos ovos pode afectar a ingestão e esvaziamento gástrico da refeição | |
| Analisador de dióxido de carbono isótopo | Los Gatos Research Inc. (Mountain View, CA) |
Referências
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Reimpressões e permissões
