Summary
Determinação do esvaziamento gástrico com um não-invasivo [
Abstract
Estudos de esvaziamento gástrico em ratos têm sido limitadas pela incapacidade para acompanhar alterações gástricas esvaziamento no mesmo animal uma vez que as técnicas mais vulgarmente utilizados necessitam de matar os animais e recuperação pós-morte de 1,2 a refeição. Esta abordagem evita a estudos longitudinais para determinar alterações no esvaziamento gástrico com a idade e progressão da doença. A comummente utilizados [13 C]-octanóico teste de respiração para os seres humanos ácido 3 foi modificado para utilização em ratinhos e ratos 4-6 e 7 que anteriormente mostraram que este teste é de confiança e sensível às mudanças no esvaziamento gástrico em resposta a drogas e durante progressão da doença diabética 8. Neste vídeo de apresentação do princípio e aplicação prática deste teste modificado é explicado. Como no estudo anterior, os ratinhos NOD LTJ são usados, um modelo de diabetes do tipo 1 9. A proporção destes ratos desenvolvem os sintomas de gastroparesia, uma complicação da diabetes caracterizadas por esvaziamento gástrico retardado, sem obstrução mecânica do estômago 10.
Este artigo demonstra como treinar os ratos para testes, como preparar a refeição de teste e obter 4 hr gástricas dados esvaziamento e como analisar os dados obtidos. O analisador de isótopo de carbono utilizado no presente estudo, é adequado para a amostragem automatizada de amostras de ar de até 12 ratinhos, ao mesmo tempo. Esta técnica permite o acompanhamento longitudinal de esvaziamento gástrico a partir de grupos maiores de ratos com diabetes ou outras doenças de longa duração.
Introduction
Este manuscrito descreve as considerações técnicas e metodológicas envolvidas na medição não invasiva do esvaziamento gástrico em ratos. Seguindo o protocolo descrito aqui, os investigadores podem de forma fiável e reproduzível acompanhar as alterações no esvaziamento gástrico, devido ao desenvolvimento de uma doença, estudar o impacto dos agentes farmacológicos sobre o esvaziamento gástrico e seguir a resposta de esvaziamento gástrico para o tratamento de doenças subjacentes ou defeitos 6,8, 11,12. Em publicações anteriores, a aplicação de 13 C do ácido octanóico testes de respiração mostrou ser uma forma útil de medir o esvaziamento gástrico nos seres humanos e animais 3,8. Este trabalho descreve, em detalhe, os procedimentos necessários para obter dados fidedignos sobre a 8 6 para meses necessários para um estudo longitudinal de esvaziamento gástrico em ratos com diabetes. As vantagens de seguir este protocolo, quando comparada com os métodos anteriormente publicados são de que o investigador pode ser assegurado o obtaine dadosd será confiável e reprodutível. Além disso, o sistema automático de recolha e análise de amostras de gás aqui descrita aumenta o número de animais que podem ser seguidos simultaneamente em estudo. No geral, o objetivo deste trabalho é identificar os principais fatores que mantêm a habituação dos ratos para o teste e que reduzir a variabilidade nos resultados obtidos.
Para a medição in vivo de esvaziamento gástrico, os ratos são alimentados durante a noite e colocados nas câmaras de ensaio de plástico transparente, com fluxo de ar constante. Depois de os ratos ficam habituados aos tubos, de linha de base exalado 13 níveis de CO 2 são determinadas e o fluxo de ar ajustado de acordo. Em seguida, administrar uma refeição de teste consistindo em gema de ovo misturado com 13 C-rotulado ácido octanóico. Porque os ratos são jejuou e treinados, eles geralmente comem a refeição de teste dentro de 2 min. A administração de ácido octanóico não é absorvido no estômago, mas será retomado no duodeno umd vai ficar metabolizada no fígado em 13 CO 2, o qual é libertado e expirado, resultando num enriquecimento de 13 CO 2 no ar circundante. As amostras de ar são recolhidos em intervalos de tempo determinados e são analisados pelo analisador de isótopo de carbono. O passo limitante da velocidade, em todo este processo é o esvaziamento gástrico e a excreção pulmonar de 13 CO 2 corresponde directamente com o esvaziamento gástrico da refeição rotulados.
Figura 1. Esquemática do aparelho de esvaziamento gástrico. Após jejum, os ratos são colocados em câmaras transparentes, permitindo-lhes mover e girar livremente. Um tubo de entrada permite que o influxo de ar fresco e constante e uma saída conduz ao analisador de isótopo para medir a 13 C a 12C em relação a respiração exalada. A câmara também tem uma porta central para fornecimento de alimentos contendo [13 C]-ácido octanóico.
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Protocol
1. Treinamento e habituação dos Ratos
- Antes da análise, colocar todos os ratos em câmaras de teste de 2-4 horas, com o fluxo de ar constante, a fim de se habituam-as às condições de teste. Isso reduz acentuadamente a níveis de tensão que de outra forma poderiam causar detecção aberrante de esvaziamento gástrico retardado. Tratar os ratinhos do mesmo modo que se a experiência do esvaziamento gástrico foi executado. Prepare gema de ovo (ver mais adiante) sem adição de ácido octanóico e alimentar 0,2 g a cada rato.
- Repita esse processo até que os ratos são suficientemente treinados (tipicamente 2-3 vezes). Os ratos tipicamente são facilmente habituados, desde que as condições ambientais são mantidos os mesmos.
Nota: Não habituados ratos continuam a se mover em torno de cerca de 1 hora após a transferência para a câmara, e defecar e urinar com frequência, enquanto os ratos habituados rapidamente resolver em seu novo ambiente e descansar tranquilamente.
Nãote: Durante o experimento: os animais monitorar os sinais de perda de habituação, como urinar em excesso, a defecação, a falta de interesse em comer o ovo. Se este for o caso, considerar re habituating em uma câmara vazia 1-2 vezes antes de obter os dados de esvaziamento gástrico. A consistência é extremamente importante ao fazer esta experiência. Fazer as coisas exatamente da mesma maneira todas as vezes é a única maneira de obter resultados confiáveis e reprodutíveis. Isto inclui fornecer o tratamento (por exemplo, insulina), a cada dia, ao mesmo tempo, não separar os ratos dos seus companheiros de gaiola, a menos que seja absolutamente necessário, os ratos em jejum e de iniciar o teste o esvaziamento gástrico ao mesmo tempo, e manipulação dos ratos da mesma maneira.
2. Preparação do Isotope contendo farinha de Teste
- Comece com pesar 5 g de gema de ovo em um tubo falcon 50 ml. Repita essas etapas cada dia experimental para preparar uma refeição de teste fresco.
- Adicionar 10 ul de ácido octanóico com um Concentrção de 2 ul / g para o tubo de 50 ml Falcon contendo o ovo e misturar vigorosamente durante 1 min, com uma espátula no tubo falcon.
- O ovo é então transferido para um béquer de vidro e aqueceu-se ao longo de um bico de Bunsen até que coagula e a sua consistência é adequado para fazer pequenas bolas. Isso normalmente leva cerca de 30 segundos.
Nota: As bolas de gema de ovo deve pesar 0,2 g por mouse. Isto é importante para manter a dose cumulativa constante em todos os ratos.
3. Do início do experimento
- Uma vez treinados e prontos para o esvaziamento gástrico rápido, os ratos durante a noite (12 horas) em um metal "malha inferior" rack jejum para evitar coprofagia. Certifique-se de que eles têm livre acesso à água potável. Uma vez que são utilizados ratos diabéticos na experiência actual, eles não devem ser sujeitos a jejum durante mais de 16 horas.
- Comece definindo-se as câmaras de esvaziamento gástrico. Use câmaras limpas e tampas que tenham sido secos ao ar. Além disso, qualquertubos que ligam as câmaras para o analisador de CO ou o fornecimento de ar 2 deve estar isenta de humidade, a água pode interferir com o sinal lido pelo analisador
- Conectar as câmaras para os tubos de entrada que proporcionam um fluxo de ar constante. Em seguida, ligar os tubos de saída das câmaras para a máquina. Fechar os tubos e ligar o fluxo de ar.
Nota: aplicar uma pequena quantidade de vaselina no final das tampas de cobertura assim que se fecham de forma fácil e estão firmemente selado. Esta vedação é necessário recolher todo o dióxido de carbono produzido pelos ratos.
4. Procedimentos Experimentais
- Comece por pesagem de cada rato. O peso corporal é uma medida da sua saúde continuada bom. Em seguida, coloque cada rato na câmara apropriada. É claro que é importante que o ar que flui para dentro das câmaras no momento.
- Para iniciar a medição, permitir que os ratos para se aclimatar para as câmaras antes de ajustarção dos níveis de ar.
- Uma vez que os ratos aparecem calma, o que pode demorar alguns minutos, ajustar a taxa de fluxo de ar para cada câmara de mouse. Isto pode ser diferente para cada rato. Tipicamente, o fluxo de ar é ajustada no início da experiência para se certificar de que o CO 2 exalado atinge níveis detectáveis por qualquer que seja o equipamento está a ser utilizado, e para certificar-se de que o nível permanece suficientemente baixa para garantir a circulação de ar saudável. Usamos iniciais níveis de CO 2 entre 1.000 e 1.500 partes por milhão.
- Se ter dificuldade com os ajustes, verificar se há vazamentos de ar. Em seguida, repita o processo para cada uma das câmaras e prestar atenção para uma nova rodada de medidas para ver se os ajustes feitos ao fluxo de ar ter corrigido o nível de CO 2. É importante para se obter uma linha de base estável da leitura antes da alimentação dos animais. Nós usamos uma máquina com um recurso de auto-calibração. Se este não é o caso de calibração deve ser verificada.
- Quando isto for conseguido, administrar a refeição ovopara o primeiro registo do tempo e do rato a cada rato recebe os alimentos.
- Corremos o procedimento para 4 horas para obtenção de valores suficientes para a montagem da curva 13 CO 2 para o enriquecimento de cada rato. Confira os ratos a cada 30-60 minutos para se certificar de que os níveis de CO 2 são ainda seguros para os ratos.
- Preparar novas caixas contendo o alimento antes do final do teste, de modo que os ratos podem começar a comer imediatamente após o teste terminou.
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Representative Results
Um conjunto de dados representativos a partir de três ratinhos diferentes é mostrada na Figura 2. O gráfico preto representa os pontos de dados de um rato, com o esvaziamento gástrico normal. Ela mostra a fracção de 13 C, que é recuperado no ar exalado, expressa em percentagem da dose administrada por hora expresso como uma função do tempo. A curva azul é a partir de um ratinho com um esvaziamento gástrico acelerado com um valor de meia T de 40 minutos e a curva de vermelho é de um rato com um esvaziamento gástrico retardado, com um valor de meia T de 168 min. Conforme estabelecido em um estudo anterior em nosso laboratório 7, o tempo de esvaziamento gástrico metade do normal para a idade do mouse não diabéticos NOD 9-15 semanas faixas de 62-131 min representados pela caixa cinza. Os pontos de dados são, então, montado por uma curva de regressão não-linear com a seguinte equação 8:
y = b em e-ct
Onde y é a percentagem do
é calculado a partir de um processo de integração numérica, usando uma função gama inversa. Temos obtido resultados de vários milhares de estudos com uma variabilidade intra-mouse biológica de cerca de 10%.
Figura 2. Representante gástricas dados esvaziamento de três ratos com diferentes normal (curva preta), tardia (curva vermelha) e acelerado (azul) curva o esvaziamento gástrico. Caixa cinza destaca valores normais. A equação de curvas de regressão não-linear é mostrada na caixa.
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Discussion
A técnica aqui descrita permite uma repetida e não-invasiva de medição in vivo de esvaziamento gástrico em ratos sólido. Este sistema tem a vantagem de que os animais não são retidos na câmara de medição, o que lhes permite mover-se e girar livremente. Uma vez que este é um ambiente desconhecido, os ratos ainda precisam ser treinados e habituados às câmaras de testes para evitar efeitos do estresse sobre o esvaziamento gástrico. De um modo geral, nós assumimos os dados de esvaziamento gástrico são fiáveis se a variabilidade intra-rato entre consecutivas gástricas testes de esvaziamento é inferior a 10%.
Este relatório é uma descrição mais detalhada dos nossos relatórios anteriores sobre gástricas medições esvaziamento em camundongos 8,11,12 e inclui informações adicionais sobre a solução de problemas problemas com o sistema. A principal modificação consiste na utilização do isótopo LGR analisador para a medição de níveis de gás. O analisador foi utilizado no presente estudo, mede 12 CO
Os principais armadilhas para esta técnica ocorre quando os ratos não conseguem comer a refeição dentro do prazo estipulado, quando os ratos perdem sua habituação à câmara e, quando surgem problemas técnicos com a detecção sysma. Deixar de comer a refeição e perda de habituação são geralmente uma conseqüência de não seguir o passo crítico de ter um horário regular para o teste. Depois de três testes consecutivos separados por 7 dias ou menos, os nossos ratos habituado à prova e comer a refeição. Uma vez habituados, fiáveis são obtidos se os ratinhos são testados pelo menos uma vez a cada 2 semanas durante o resto da experiência. Se, por alguma razão, os ratinhos que não foram testados durante 3 semanas ou mais, em seguida, duas sessões de treino dentro de uma semana, geralmente garantir a habituação. Se o pessoal que manuseia os animais mudar, então re-treinamento dos ratos é aconselhada e é particularmente importante para desencorajar o uso de sabonetes fortemente perfumados e / ou perfumes pelas pessoas que manipulam os ratos. Dificuldades com o sistema de detecção são muitas vezes devido aos baixos níveis de 13 CO 2 geradas por um pequeno animal parecido com um rato. O detector deve ser calibrado e, para alguns, tais como detectores de infra-vermelhos à base de sistemas, é muito important para reduzir o conteúdo de água da amostra a um mínimo antes de medições.
Há algumas limitações para esta técnica, a menos que o investigador pretende estudar o esvaziamento gástrico mais frequentemente do que uma vez a cada 3 dias, no mesmo rato. Não é aconselhável para o mouse rápido tantas vezes e restrição alimentar como em uma base regular, pode alterar a função gástrica. Modificações na técnica podem ser feitas para medir o esvaziamento gástrico de líquido e que é uma aplicação útil do método potencial.
Outros métodos para a avaliação do esvaziamento gástrico, incluindo cintigrafia ou a medição de conteúdo retido depois de um tempo fixo têm limitações significativamente mais, incluindo problemas com o stress do processo ou devido à necessidade de matar o animal no final de cada teste. Estressores incluem gavagem da refeição de teste ou de contenção dos animais durante a medição. As vantagens do teste de respiração são de que o rato está movimentando-se livremente e não anestesiadosou sedado de forma alguma.
Em resumo, o 13 C-octanóico teste respiratório ácido permite o estudo da progressão da doença com a idade e o tratamento e estes dados podem então ser correlacionada com as alterações em outros parâmetros fisiológicos e avaliação histológica no mesmo animal. Entre outras aplicações, o teste também permite o estudo de como as drogas podem modificar directamente o esvaziamento gástrico, bem como estudar a resposta ao tratamento em animais que desenvolvem alterações no esvaziamento gástrico devido a doença ou outras intervenções.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.
Acknowledgments
Esta publicação vídeo foi possível graças ao financiamento do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (NIDDK) para o Projeto Programa de Grant "Patobiologia do Sistema Entérico" DK 68055. Christopher T. Creedon foi apoiado pelo Programa de Mentoria Rochester Escolas Públicas.
Agradecemos o Sr. Gary Stoltz para assistência técnica, a Sra. Kristy Zodrow para secretariado assistência e Douglas Dr. Baer, de Los Gatos Research, Inc (Mountain View, CA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A source of constant air-supply, flow as well as composition | central air supply in the research facility | ||
| 130 ml sampling chamber that has air inlet, air outlet, and food administration opening Plastic tubes for air supply |
In-house built | ||
| Octanoic acid | Cambridge isotope laboratories (Andover, MA) | CLM-293-1 | |
To prepare the egg meal:
|
Any supplier | Try to be consistent with the egg supplier since the nutritional content and palatability of the eggs can affect ingestion and gastric emptying of the meal | |
| Carbon dioxide isotope analyzer | Los Gatos Research Inc. (Mountain View, CA) |
References
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![Estudo do esvaziamento gástrico em ratos diabéticos não obesos utilizando a [<sup> 13</sup> C]-octanóico teste de respiração Ácido](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/50301.jpg)
