Summary
Canlı hücre göç çalışmaları için bir mikroskop odasında yapıştırıcı ve çözünür degradelerin montajı için bir yöntem tarif edilmiştir. Mühendislik ortamı çözümü degradelerle antifouling yüzeyleri ve yapıştırıcı parçaları birleştirir ve bu nedenle bir rehberlik ipuçları göreli önemini belirlemek için izin verir.
Abstract
Hücreler gibi ekstrasellüler matriks ve bu büyüme faktörleri gibi çözünür ipuçlarının glikoproteinleri gibi yapışkan ipuçlarının yüksek konsantrasyonlarda doğru algılayıp geçirebilirsiniz. Burada, canlı hücre görüntüleme ile uyumlu bir mikroakışkan haznesi, yapışkan ve çözünebilir ipuçlarının karşıt degradeler oluşturmak için bir yöntem özetlemektedir. Poli-L-lisin ve polietilen glikol (PEG-PLL) bir kopolimerin cam lameller etkisizleştirmek ve biyomoleküller ve hücre spesifik olmayan adsorpsiyon önlemek için kullanılır. Daha sonra, mikrokontak baskı ya da daldırma kalem litografi yapıştırıcı işaret olarak biyotinile peptid arjinin-glisin-aspartik asit (RGD) için bağlantı noktaları olarak görev yapan pasif yüzeyler üzerinde streptavidin üzerinden parçaları oluşturmak için kullanılır. Bir mikroakışkan cihaz modifiye edilmiş yüzeye yerleştirilir ve streptavidin parça üzerinde yapışkan işaretler (100% 0 ile% RGD RGD) ve gradyan oluşturmak için kullanılır. Son olarak, aynı mikroakışkan cihaz bir kemoatraktan Suc bir gradyan oluşturmak için kullanılıryapışkan ipuçlarının gradyanı ters yönde çözünür işaret olarak fetal bovin serumu (FBS), gibi h.
Introduction
Yönetmen hücre göçü birçok hücre temel bir özelliğidir ve embriyonik gelişim, enfeksiyona karşı savunma ve yara iyileşmesi gibi birçok normal fizyolojik süreçlerin, önemli bir yönüdür. Buna ek olarak, hücre göçü aynı zamanda damar hastalığı, tümör hücre metastazları ve kronik inflamasyon 1,2 gibi pek çok hastalıkta önemli bir rol oynar. Hücreleri klasik göç ülkeleri iken - polarizasyon, protrüzyon genişleme, adhezyon, kuvvet oluşturma ve arka retraksiyon oluşumu - genellikle 3,4 kabul edilir, sinyal entegrasyon koordine edildiği zamanmekansal mekanizmalarının aydınlatılmasında daha zor olmuştur.
Ekstrasellüler matriks (ECM) hücre yapışması için bir substrat olarak hizmet verir ve doğal kimyasal ve fiziksel 5 6 çeşitliliği ile, cep navigasyon 7,8 için directional kuyruklarını sağlar. Bu yapışkan işaretler 9, çözünür faktörlerin 10-12 ek olarak </ Sup> gibi kemokin ve büyüme faktörleri gibi olabilir kemoatraktan reseptörleri ve onların aşağı motogenic sinyalizasyon yönlendiriliyor hücre göçü teşvik. Şu anda, nişan ve adezyon reseptörleri (yani integrinler) ya da reseptör tirozin kinaz (RTK) olarak kemoatraktan reseptörleri yoluyla sinyal, baskın olup olmadığı bilinmemektedir. Ne de reseptör sistemlerinin hiyerarşileri hücre tipine özgül olduğunu bilinmektedir.
Canlı hücresi mikroskopi toplu tayinlerde erişilebilir değildir ve immobilize 13,14 ve çözünür ipuçları 15 16 degradeleri oluşturmak için mikroakışkan cihazlar ile kombine edilebilir bir bilgi zenginliği verir. Burada açıklanan yöntem kolayca bir hücre biyolojisi laboratuvar (Şekil 1) de uygulanabilir olması hücre göçü için bir görüntüleme tahlil oluşturmak için ticari olarak mevcut microfluidic bölme ile bağlantılı olarak yüzey modifikasyonu için basit ve köklü bir dizi adım kullanır. MonteMikroakışkan cihaz cam 17 ile karşılaştırılabilir ve dağılabilir molekül gradyanlar en az 16 saat boyunca stabil optik nitelikleri vardır. Sistem Epifloresans ve ileri mikroskopi için teknikler de kullanılabilir. Diğer kemotaksisi düzeneklerinin 18 farklı olarak, bu sistem yavaş yavaş göç eden, yapışık hücre kayıt için uygundur. Önemlisi, sistemin modüler ve kolaylıkla alternatif yapıştırıcı veya çözünebilir göç ipuçları ve çeşitli hücre tiplerinin incelenmesi giriş sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PLL-PEG-biotin ile cam lameller arasında Pasivasyon
Bu adım, hücreler microcontract baskı (Adım 2-3a) ya da daldırma kalem litografi (Adım 3b) ile oluşturulan cam lamel üzerinde belirli bölgeleri üzerine yapışır ve geçiş böylece yüzey etkisizleştirmek için tasarlanmıştır. Pasivasyon için, poli-L-lisin (PLL), ve polietilen glikol (PEG) arasında bir ko-polimer PEG moleküllerinin 20% biotin (-PEG-PLL biotin) ile aşılanmış olan kullanılır.
- Cam lameller (18 mm x 18 mm),% 100 etanol rafa daldırın onları temiz ve 30 dakika için bir sonicating banyo rafı yerleştirin. Hava ya da azot akışı altında cam lameller kurutun.
- Daha sonra, 1 M NaOH içinde 30 dakika için cam lameller sonikasyon. Daha sonra dikkatli bir 1,5 L Milli-Q H 2 O ile dolu bir behere raf daldırma cam yüzeyleri durulama Durulama işlemi taze Milli-Q H 2 O her zaman kullanarak üç kez tekrarlayın. Içinde cam lameller kurutun60 ° C'de bir fırında
- Temiz bir cam il kısmen yarı H 2 O ile dolu bir 24 oyuklu plaka yapılmış bir nemli oda içinde ayrı ayrı lamelleri Her bir cam lamel üzerinde PBS-PEG-PLL biotin (1 mg / ml) 15 ul bırakın. Kalan temiz cam lamelleri diğer yarısını al ve dikkatlice sandviç PEG çözüm. Nemli oda içinde, 1 saat boyunca lamelleri bırakın. PEG-kaplı yüzey kazıma olmadan yavaşça Birbirlerinden uzakta bulunan sandviç lamelleri getirin ve Milli-Q H 2 O ile durulayın Su PEG-tedavi tarafında kolayca kapalı slayt gerekir. Gerekirse, tedavi edilen yüzey ile kağıt havlu üzerinde kurumaya cam lameller yukarı bakmaktadır. Daha fazla kullanıma kadar bir vakum desikatörde cam lameller saklayın.
2. Mikrokontak baskı için Pullar fabrikasyonu
Biz pasifleştirilmiş cam lameller üzerine desen streptavidin parçaları iki süreç açıklanmaktadır. İlki, mikrofonrocontact baskı, genellikle bir PDMS damga artığını hangi bir silikon master imalat gerektirir. Bizim durumumuzda, PDMS damga üzerine desen 25 um bir özelliği yüksekliği ile 290 mikron merkez merkeze aralıklı 100 mikron çapında çizgilerdir. Aşağıda, biz uygun bir silikon master (Adım 2.1-2.3) ve PDMS damga (Adım 2.4) imal nasıl kısaca tanımlayınız. Bununla birlikte, cam lameller üzerine protein yapısı baskı için uygun olan literatür 19-23 'de tarif mikrokontak baskı için çok protokol vardır. Ustalar da özel yapılmış ve ticari kaynaklardan satın alınabilir.
- MilliQ H 2 O ile iyice 10 kez, 20 dakika için gofret yıkayın.: İlk olarak, pirana çözeltisi (v sülfürik asit ve% 30 hidrojen peroksit 3:01 v) içinde inkübe edilerek silikon gofret (4 "çapında) temiz 150 fırında gofret kurulayın ° CO / N.
- 100% izopropil alkol izledi% 100 aseton ile temiz ve kuru silikon gofret, durulayın. Sonraki40 sn için 3,100 rpm'de gofret üzerine GM1070 SU-8 fotorezist (Gersteltec Sarl) spin-kat 2 ml 25 mikron kalınlığında bir katman yaratmak için. Örnek sonra 95 daha 5 dk ardından 5 dakika ° C için 65 ° C'de sıcak bir plaka üzerinde pişirilir
- Istenilen desen (Bir Quintel Q6000 maske hizalama kullanarak örneğin) bir Fotoşablonlarda altında 60 sn süreyle UV ışığına SU-8 fotorezist Açığa ve pişirme işlemi 2.2 tarif tekrarlayın. Sonra örnek 100% izopropil alkol durulanır ve azot akışı altında kurutuldu 4 dk için SU-8 geliştirici (Gersteltec Sarl) olarak gofret daldırarak tarafından geliştirilmiştir. UV ışığa maruz değildi SU-8 fotorezist alanı böylece PDMS damga ters desen oluşturarak, kaldırılır.
- Sonraki adım silikon usta bir PDMS damga döküm olduğunu. İlk olarak, iyice elastomer prepolimer 10 kısım (Sylgard 184) ile sertleştirme maddesi 1 kısmı (w / w) karıştırılır. Bir vakum hattında bağlı bir desikatör içinde gazdan arındırmak sonra, karışım hava kabarcıklarını çıkarmak için:1 saat için. Sonraki, yüksekliği yaklaşık 1 cm bir Petri kabı içine silikon ana üzerine PDMS elastomer dökün ve 1 saat boyunca 70 fırında ° C master ve PDMS karışımı kür. Son olarak, PDMS pul silikon kalıp çıkarılır ve ebatlara kesilir.
3. Pasifize Cam lameller üzerine desenlendirme Streptavidin veya Yapıştırıcı Cues
Cam lameller pasivasyon sonra, protein modelleri mikrokontak baskı (Adım 3a) ya da dip-kalem litografi (Adım 3b) yazdırılır. Bizim durumumuzda, streptavidin RGD eğimleri (Adım 4) için temelini oluşturan çizgiler olarak yazdırılır. Aynı prosedür, aynı zamanda yapışkan desenler oluşturmak için matris proteinleri baskı için de kullanılabilir.
Yüzeylere biyomoleküllerin desenlendirme için mikrokontak baskı için alternatif bir yöntem daldırma kalem litografi olduğunu. Daldırma kalem litografi, bir konsol yüzey üzerine çözelti küçük bir hacim transfer etmek için kullanılır. Sundurmalar boyutu, vÇözeltinin iscosity, yüzey üzerinde konsol temas süresi, baskı odasında yüzey hidrofobikliği ve nem basılı özellikleri boyutunu belirler. Bu yöntemin avantajı, usta ve pul üretmek için gerek yoktur gibi değişik şekilleri, her bir deney için basılabilir olmasıdır. Dezavantajı belirli bir desenini yazdırmak ve daldırma kalem litografi birçok laboratuvarda mevcut olmayabilir, bir uzman alet gerektiren uzun sürer olmasıdır. Biz kullanılan daldırma kalem litografi cihazı Bioforce Nanobilim gelen NanoeNabler oldu. Burada, biz Spt10 konsol kullanıldığı için, çapı <10 mikron idi küçük noktalar yazdırılır.
3a. Mikrokontak Baskı (μCP) Tekniği
- Temizlemek ve PDMS damga daha fazla hidrofilik hale, 1.5 saat için bir UV ve ozon (Bioforce Nanobilim dan, örneğin, UV Ozon Procleaner) içinde PDMS pul desenli yan tedavi etmek için. Alternatif olarak, bir plazma kullanmakAynı amaç için daha kısa bir süre için temizleyici. Bu işlem, baskı işlemini geliştirir bir okside PDMS yüzey 24 oluşturur.
- Ozon ya da plazma muamele, yer ve PDMS pul üzerine 10 ul streptavidin (PBS içinde 1 mg / ml) yayılır ve nemli oda (örneğin, kısmen doldurulmuş 6-plaka gibi, Aşama 1.3) içinde 1 saat boyunca izin hemen sonra . Parça floresan mikroskop altında görülebilir olmalıdır, örneğin streptavidin AlexaFluor350 olarak fluorofor bağlanmış olduğu streptavidin kullanın.
- Kağıt mendil ve hava yaklaşık 1 dakika boyunca damga kuruması ile damga fazlalıklar streptavidin çıkarın. Hafifçe PLL-PEG-biotin-kaplamalı cam lamel üzerine damga basın.
- Fluoresan streptavidin Adım 3.a2 olarak kullanıldığında ise, bir mikroskop altında Epifloresans kullanılarak desen incelemek. Bir desikatörde baskılı yüzeyleri saklayın.
3b. Dip Pen Litografi
- İlk olarak, 1 mg / ml streptavidin ya da stre 1 kısım karıştırma10 kısım gliserol (v / v) ile ptavidin-AlexaFluor350 ve dirsek üzerine karışım 5 ul yükleyin. Daldırma kalem litografi aracın kullanım kılavuzunda anlatıldığı gibi Sonra yazdırma işlemi başlar. Yaklaşık 5 um nokta boyutunu azaltmak için, yazdırma hızını ayarlamak, yüzeye konsol yüzeyinde veya dikey mesafeye konsol zaman başvurun. Şekil 2c 'de gösterilen örnekte, noktalar, satır ve 10-15 um sütun ayırma ayarlanmış olan bir çizgi halinde basıldı. Bu mesafe birbirine birleştirilmesi gelen noktalar önlemek için yeterli olduğunu ancak çoğu mikroskop ayarları ile görünümü tek bir alanda birden fazla nokta görüntülenmesini sağlar.
- Bir desikatörde baskılı yüzeyleri saklayın.
4. Streptavidin desenli yüzeyler üzerine Yapıştırıcı Degradeler oluşturma
Biz, streptavidin (Şekil 3) ya da işbirliği ile kaplanır cam lameller üzerine biyotin-RGD bölgesinin yapışkan gradyanları oluşturmakpasifleştirilmiş cam lameller üzerine ntain streptavidin desenleri (Şekil 5). Bir yüzey degrade oluşturmak için, biz pasif difüzyonla istikrarlı bir çözüm degrade oluşturur piyasada mevcut mikroakışkan cihazı (Ibidi gelen yapışkan-Slayt Kemotaksis 3D denir) kullanılır. Streptavidin bağlanma yerleri için rekabet için, (bkz. Şekil 1) RGD konjuge değildi biotin RGD ve biyotin iki zıt degradeler istihdam.
- Yapışkan-Slide Kemotaksis 3D cihazın yapışkan yüzüne streptavidin kaplı ya da desenli bir cam lameller dikkate alınmalıdır. Birkaç saat süreyle hiçbir sızıntı olmamasını sağlamak için, cihazın kenarları ısıtılan vazelin ince bir tabaka ile ve parafin mum, 1 kısım (w / w) ile vazelin 1 kısım bir karışımın bir ikinci tabaka ile kapatılır.
- Kanal içinde 6 ul PBS ile cihazın kanal doldurun. Sonra, PBS ve 70 ve m de 0.03 mg / ml 'den biyotin-4-florosin 70 ul ile iki rezervuar doldurmaku; 0.03 mg l / ul biotin RGD sırasıyla PBS içinde. 1 saat için karanlıkta oda sıcaklığında örnekleri inkübe edin.
- Biyotin çözüm çıkarın ve yine PBS ile iki kez mikroakışkan cihaza takılıyken dikkatlice yüzeyin durulanması. Yapışkan eğim yönü işaretleyin ve eğer gerekirse, 4 ° C'de PBS ile doldurulmuş cihaz depolamak ancak aygıt, kurumanın emin olun. Gerekirse, bir floresan mikroskop ile yapışkan degrade analiz.
5. Canlı Hücre Görüntüleme için fluorophores ile Hücrelerinin Etiketleme
Hücreler floresan mikroskopta hücre izleme yardımcı floresan boyalar ile etiketlenir. Ortak problar floresan organel belirteçleri, hücre çekirdeği etiketler gibi syto 64 Kırmızı vardır. Bunu yapmak için, hücreler ilk önce 45 dakika için kültür ortamı olarak 1 uM syto Red 64 ile inkübe edilir, PBS ile üç kez yıkanır ve son olarak PBS ile üç kez daha yıkanır. Hücrelerin olmaması gerektiğini unutmayınuzun süre için PBS içinde tutulur.
Hücre izleme için alternatif boyalar sitoplazma leke CellTracker serisi ve hücre göçü ve bölünme sırasında korunur. Floresan füzyon proteini ile hücrelerinin transfeksiyonu geçişi sırasında ilgi çekici bir proteinin hücre altı dağılımı kaydetmek için özellikle yararlıdır. Ancak, organik boyalar genellikle daha foto-ağartma hızlı floresan proteinleri, uzun süreli gözlemler için mümkün olmayabilir.
6. Mikroakiskan Cihaz içine Çözünür Gradient Hücrelerinin yükleniyor
- Eşit hücre sayıları iki tüpler içine floresan etiketli hücreleri ve split sayın. Bu tür% 10 fetal bovin serumu (FBS) ile düşük glikoz Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) gibi kemoatraktan içeren bir ortam ile birlikte bir hücre tüp yıkanır ve tekrar süspansiyon. Yıkama ve kemoatraktan,% 0 FBS ile, yani DMEM olmadan ortam içinde hücreler diğer tüp tekrar süspansiyon. Nihai konsantrasyonHer bir tüp içinde hücrelerin 5 x 10 5 hücre / ml olmalıdır.
- Mikroakışkan cihaz (Adım 4.3) gelen tüm çözümler çıkarın ve (Adım 7) mikroskop sahne üzerine yerleştirin. Bir rezervuar ve başka içine HeLa hücreleri 70 ul (% 10 FCS DMEM içinde 5 x 10 5 hücre / ml) içine hücre 70 ul (% 0 FBS DMEM içinde 5 x 10 5 hücre / ml) yerleştirin. Gevşekçe buharlaşma önlemek için rezervuar üzerinde bir kaset yerleştirin. Yüzey hücreleri önce görüntüleme için ön kuluçkaya bırakılır, bu hücrelerin gradyan olmadan büyüme ortamı olarak cihazın içine yüklenmiş olması tavsiye edilir. Cihaz daha sonra mikroskop sahne üzerine yerleştirilen ve medya diğer% 10 FBS ile bir rezervuar ve DMEM FBS olmadan degrade medya yani DMEM ile değiştirilir.
7. Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi Canlı
- Mikroskobu (Nikon Ti-E) açın ve deneme başlamadan önce en az 1 saat sahnede ısınmak.
- Emin olun MICR kanalofluidic cihaz görüş alanında yer almaktadır ve hücreler odak noktası vardır. Böyle pozlama süreleri ve floresan filtreler, hücre ve parçaları yakalar parlak alan ve floresan görüntü sırası yanı sıra zaman noktaları ve kayıt uzunluğu (örneğin 16 saat boyunca her 15 dakika) olarak görüntü alma parametresini seçin.
- Böyle ImageJ Manuel İzleme veya Ibidi Kemotaksis ve Geçiş Aracı uygun yazılımları ile verileri analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hücre göçmen sinyalleri 25 entegre anlamak için, biz rakip yapıştırıcı ve çözünür eğimleri (Şekil 1) ile bir ortamda geçirmeniz floresan mikroskobu ile görüntü hücreleri için bir yöntem geliştirdik. Floresan streptavidin biotinlenmiş RGD içerdiği Yapıştırıcı şarkıları mikrokontak baskılı parçalar ve daldırma kalem litografi (Şekil 2) ile oluşturulmuştur. Başarılı mikrokontak baskı yapışkan parçalar ve anti-kirlenme bölgeleri açıkça (Şekil 2b) ayırt edilebilir parçalar arasında floresans şiddetinin hat profili ile gösterilir. Daldırma kalem litografi baskılı noktalar yuvarlak, başarılı bir baskı işlemi gösteren, şekilli gözyaşı değil görünür. Yüzey kimyası ve nem yazdırma işleminin sonucunu etkilemektedir. Genel olarak konuşursak, daha hidrofobik yüzey, baskı sonuçları iyi.
Yapışkan ipuçları bir degradebasılı parça üzerinde biyotin-4-florosin yükleme ve mikroakışkan bölme (Şekil 3) ve karşı tarafta içine biyotin-RGD tarafından basit bir aygıt ve arayüz ile oluşturulmuştur. Her iki molekülün de cam yüzey üzerinde streptavidin parçaya rekabetçi bağlama için, RGD immobilize ligand bir gradyan oluşturulur. Biyotin / biyotin-RGD çözelti çıkarmadan sonra, aynı haznesi, en az 16 saat (Şekil 4) için mikroakışkan kanal içinde stabil bir çözünür gradient, getirmek için de kullanılabilir.
Bu FBS kullanıldığı için bir kemoatraktan gradyanı ile odasına HeLa hücreleri getirmiştir. Düşük yoğunlukları anda, HeLa hücrelerinin tercihen yapıştırılır ve streptavidin / RGD parçaları (K hücreleri = 50) üzerinde göç ve anti-kirlenme PEG bölgeleri (K hücreleri = 19) kaçınılmalıdır. Bireysel hücre pozisyon 16 saat boyunca kaydedilir ve bir hücre izleme yazılımı ile analiz edilmiştir. Bir deneyde nerede yapışkan ve çözümble eğimleri (Şekil 5), birbirine zıt olan, ayrı ayrı hücrelerin yörüngeleri daha HeLa hücreleri kemoatraktan (Şekil 5c, N izleri = 36 içinde kırmızı iz) bir kaynağına doğru göç ettiğini gösterdi yapışık RGD daha yüksek konsantrasyonları (kara karşı daha Şekil 5c, N izleri = 14 iz). Karşı (siyah izleri) veya FBS degrade (her yörünge ortalama deplasman x-bileşeni) (kırmızı izleri) yönünde göç hücreleri 0.1700 ± 0,1172 ve 0,2278 ± 0,1280, sırasıyla (p <0.0001, Öğrenci olduğu ortalama mesafe P> 0.05, Student t-testi); siyah izleri (56.18 ± 32.27 mikron) ve kırmızı izleri (72.86 ± 45.05 mikron arasında ortalama deplasman istatistiksel olarak anlamlı fark yoktu t-testi) rağmen. HeLa hücreleri 17.47 arasında bir ortalama hız ± yapıştırıcı her iki eğim varlığında, 4,72 um / saat ile göçcue (yani RGD) ve çözünebilir cue (yani FBS). Veri bu nedenle hücre yapışkan parça üzerinde bir iç geçiş hızını korurken, HeLa hücreleri, FBS gradyan göç yönünü göstermektedir.
Biz de makrofaj hücre hattı J774 göç değerlendirdik. Yapışkan ve çözünebilir gradyanlar yokluğunda, bu hücrelerin HeLa hücrelerinde çok daha yüksek hızlarda (38.55 ± 17.88 mikron / saat) (16.47 ± 4.28 mikron / saat) ama J774 hücreleri değiştirmek yönünde yani az persistensi (0.059 arasında yön ± 0,091 ile göç ), daha sık mikrokontak baskılı fibronektin pistlerde HeLa hücreleri (0.57 ± 0.12) daha az uzunluktaki izlemek için deplasman oranı olarak ölçülür. J774 hücreleri de HeLa hücreler daha bağımlı temas azdır. J774 hücrelerin yerinden fibronektin parçaları (42.95 ± 39.90 mikron) ziyade PEG bölgeleri (102.20 ± 54.73 mikron) daha yüksek idi. Buna ek bir, J774 hücrelerimezenkimal gelen amoeboid göç mekanizmaları değiştirerek farklı yüzey kimyası uyum ppeared. Onlar HeLa hücreleri için olduğu gibi Sonuç olarak, yapışkan ipuçları J774 hücrelere kadar önemli değildir. Her iki hücre tipi tercihen çözünür işaret yönüne doğru göç ettiler.
Şekil 1. Göç hücrelerinin görüntüleme yapıştırıcısı ile çözünen ipuçları zıt gradyanlar yanıt veren bir mikroakışkan kurulum fabrikasyon süreci şematik. A. Cam lamelleri ile pasifize edilir biotinlenmiş PLL-PEG. B. Floresan streptavidin içeren Yapıştırıcı desenleri biotinlenmiş üzerine yazdırılır yüzey ya olarak daldırma kalem litografi kullanarak mikrokontak baskı kullanarak çizgileri (b) veya nokta (b '). c. D. Hücreler vasıtasıyla oluşturulur ve% 0-10 arasında bir çözünür kemoatraktan degrade FBS mikroakışkan cihazın içine yüklenir. Hücre yüzeyine yapışır sonra, streptavidin parça üzerinde RGD gradyanları fazla hücre göçü ve canlı FBS gradyanlar varlığında iki rezervuar bağlantı kanalı görüntülenebilir.
Şekil 2. Hücre yapışkanlı desenler (çizgi ve noktalar) iki farklı baskı teknikleri ile oluşturulabilir mikrokontak bir Floresan görüntü streptavidin AlexaFluor350 parçaları (Abs: 346 nm, Em: 442 nm; gri) yazdırılır.. PLL-PEG-kaplamalı cam lameller üzerine. Microcontract baskı maskesi 290 mikron merkez-to-ce ile 100 mikron genişliğinde olan çizgiler olarak dizayn edilmiştirnter alanı. b. mikrokontak arasında ortalama floresan yoğunluğu yukarıdan aşağıya kesit olarak beş ayrı yüzeyler gibi gösterildiği streptavidin parçaları, baskılı. Pistin genişliği ortalama 90 ± 6 mikron ve ortalama merkezden merkeze mesafesi 293 ± 2 mikron. C. Daldırma kalem litografi ile oluşturulan streptavidin içeren noktalardan oluşan aydınlık görüntü. 15 mikron merkezi merkeze alan 9 mikron - noktaların çapları 6 arasında değişiyordu. Ölçek, bir bar ve c 100 mm'dir.
Şekil 3,. Biotin-4-floresein degrade (0 mikrogram / ul - 0.03 mg / ul). Üniform streptavidin ile kaplanmış bir cam yüzeylerde Biotin-4-floresein ve biyotin RGD mikroakışkan cihaz (yapışkan-Slayt Kemotaksis 3D ya rezervuar yüklendi , Ibidi) olduğunu, 1 mm'lik bir uzun kanal ile bağlanır. Bir 1 saat inkübasyondan sonra, cihaz, PBS ile yıkandı ve PBS ile doldurulmuş. A. 60 mozaik görüntü floresans yoğunluğunu mozaik tüm uzunluğu boyunca ölçülen bir toplam uzunluk görüntü 3.072 mikron ve b ile alınmıştır. Doğrusal trend çizgileri kanalda RGD degrade belirtmek için floresan yoğunluğu takıldı.
Şekil 4. Bir floresein degrade (0 uM - 1 uM) ve floresan yoğunluğu mikroakışkan kanal bir hemen 16 saat inkübasyondan sonra kurulumu (T = 0 saat) ve b PBS sonrası olmadan ve 1 uM ile floresein sol ve sağ yüklenmiştir. Mikroakışkan cihaz (yapışkan-Slayt Kemotaksis 3D, Ibidi), sırasıyla rezervuar. Mikroakışkan kanal 1 mm uzunluğunda ve birpozisyon 50 ila 1,050 mikron de bulunur. Gradyan en az 16 saat boyunca kararlı olmuştur.
Şekil 5,. Yapıştırıcı degrade (streptavidin pistlerde RGD immobilize) ve çözünebilir gradyan (0-10% FBS) karşıt bir mikroakışkanları odasının (yapışkan-Slayt Kemotaksis 3D, Ibidi) olarak HeLa hücre göçü. A. Bir mikroakışkanları kamarada hücre temsilcisi görüntü ile degradeler karşıt. Ölçek çubuğu 50 mikron. Bir Epifloresans mikroskobu (Nikon Ti-E) ile çekilen bir hücre b Time-lapse görüntüler. Görüntüler 20 saat ve hücre Centroid konumlandırma (ImageJ manuel izleme eklentisi) yoluyla elde edilen hücre yörünge (mavi çizgi) ve 15 dakika aralıklarla alındı. Ölçek çubuğu 50 mikron. C. Hücre yörünge görüntüleri b 'de gösterildiği gibi. Hücre trçözünür FBS yüksek konsantrasyonda doğru göç ajectories kırmızı (N izleri = 36) gösterilir; yapışık RGD yüksek konsantrasyonlarda doğru göç hücre yörüngeleri siyah (N izleri = 14) 'de gösterilmiştir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, hücre göçü üzerine kimyasal olarak modifiye yüzeyler ve kemoatraktan degradelerin etkilerini incelemek için (Ibidi gelen yapışkan-Slayt Kemotaksis 3D) piyasada satılan bir mikroakışkan cihaz kullanılır. Gradyan kanalın uzunluğu boyunca difüzyon ile kurulmuş olmasıdır mikroakış ayar akış gerektirmez. Akış ayirt kararlı gibi fokal adezyon ve küçük odak kompleksleri ve sinapsların 26 oluşturacak en lökositler gibi hızlı göç hücreleri oluşturmak fibroblastlar gibi yavaş yavaş göç hücreleri etkileyebilir, çünkü bu önemlidir. Laminer akış Kayma gerilmesi çözünür kuyrukları 27,28 yönelik yapıştırıcı ipuçları ve hücre kemotaksis hücre yapışma istikrarı etkileyebilir. Biz yavaş hareket HeLa hücreleri ve böylece mikroakışkan kurulum hem yapışık ve az yapışık hücre türleri için geçerli olduğunu gösteren hızlı hareket J774 hücreleri arasındaki göç davranış farklılıkları bulundu. Bu tür karşılaştırmalar da revealeyapıştırıcı ipuçları (RGD peptid veya fibronektin) ve anti-kirlenme bölgeleri (PEG alanlar) hem içerdiği yüzey desenleri yapışmasını ve göç yanıtları hücre türleri arasındaki d ilginç bir fark.
Yüzey desenleri mikrokontak baskı 29 ve dip-kalem litografi 30,31 ile oluşturulmuştur. Mikrokontak baskı basit ve nispeten hızlı, tekrarlanabilir desenlendirme süreçtir. Ancak, fotolitografi sağlanır PDMS damga, tasarım ve üretim daha fazla içine alan ve zaman alıcıdır. Aynı zamanda bu küçük özellikler (<5 mikron) desen boy oranına ulaşmak ve bağlı zor olan kendi sınırlamaları tanıttı. Kısaca, mikrokontak baskı mikron boyut yüzlerce ve aynı kalıpları pek çok kere yaratılan için gereken deney kadar geniş desen için idealdir. Diğer taraftan, daldırma pim litografi nanoscaled mikron desen oluşturmak için de kullanılabilir. Bu baskı nokta daha uygundurhatlarına kıyasla, her ne hatları imal edilebilir. Prefabrike maskeleri, yüksek lisans veya pullar için gerek yoktur gibi Dip pin litografi, desen tasarımları büyük bir özgürlük tanıyor. Bununla birlikte, modelleme işlemi hızını hantal ve özel bir alet erişim büyük alanların baskı çok önemli hale yavaştır. Boyutu ve yapışkan isteka desen şekli hücre göçü 32,33 düzenleyen biyomekanik makine organizasyon ve dağılımını etkileyen çünkü iki desenlendirme yöntemleri dikkate ilgilidir. Ayrıca, burada kullanılan ticari mikroakışkan cihazın sınırlaması kanal uzunluğu (1 mikron) değiştirilemez ve böylece bir yapıştırıcı ve çözünür degradelerin maksimum dikliğini kontrol edemez olmasıdır. Diktir gradyanlar gerekli ise, bir iki rezervuar arasında daha kısa bir kanal ile bir mikroakışkan cihaz imal etmek gerekir. Burada açıklanan protokol önemli bir avantajı, modüler tasarım, farklı su böylecerfaces, yüzey kimyası, modelleme yaklaşımları ve mikroakış cihaz canlı hücre görüntüleme deneyleri, çok çeşitli için kombine edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa etmek hiçbir ticari çıkarları var.
Acknowledgments
Yazarlar Avustralya Araştırma Konseyi ve Ulusal Sağlık ve Avustralya Tıbbi Araştırma Konseyi fon kabul ve teşekkür Mikrokontak baskı için SU-8 master için Avustralya Ulusal İmalat Tesisi. SHN Yükseköğretim Malezya ve Universiti Sains Malezya Bakanlığı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverglass staining outfits | Thomas Scientific | 8542 E40 | Coverslip rack |
| Oven | Binder | ED 53 series | |
| Silicon wafer | Silicon Quest | 708-007 | Boron doped <100> wafer, 4" diameter, 500 μm, single side polished |
| GM1070 SU-8 photoresist | Gersteltec Sarl | ||
| SU-8 developer | Gersteltec Sarl | ||
| Sylgard 184 curing agent | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 elastomer prepolymer | Dow Corning | ||
| PLL-PEG-biotin (20%) | SuSos AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | 1 mg/ml in PBS |
| Fluorescein | Sigma | 46955 | 1 mM in PBS |
| Streptavidin-AlexaFluor350 | Invitrogen | S-11249 | 1 mg/ml in PBS |
| Biotin-4-fluorescein | Invitrogen | B-1370 | 0.03 μg/μl in PBS |
| Biotin-RGD | GenScript | SC1208 | 0.03 mg/ml in PBS |
| Syto 64 Red | Invitrogen | S-11346 | 1 μM in PBS |
| Sticky slide chemotaxis 3D | Ibidi | 80328 | |
| 200 μl Greiner yellow bevelled tip | Greiner Bio-One | 739261 | |
| Vaseline | Sigma | 16415 | |
| Paraffin wax, mp 55-57 °C | Sigma | 327204 | |
| Nano eNabler 10 μm cantilever | BioForce | SPT-S-C-10s | |
| Image J software | National Institute of Health | rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Manual Tracking plugin | Fabrice Cordelières | rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | |
| Chemotaxis and Migration Tool | Ibidi GmbH | www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html |
References
- Pulsipher, A., Yousaf, M. N. Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration. Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).
- Hall, A.
- Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
- Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. Environmental sensing through focal adhesions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).
- Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A.
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).
- Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e, Gooding, J. J., Gaus, K. How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration. Journal of Oncology. 2010, 363106 (2010).
- Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate. Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).
- Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
- Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128 (2011).
- Chung, B. G., et al. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271 (2007).
- Rhoads, D. S., Guan, J. L. Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules. Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).
- Park, J., et al. Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel. Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).
- Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).
- Frequently Asked Questions (FAQ) :: ibidi [Internet]. , ibidi GmbH. Available from: http://www.ibidi.com/service/faq.html (2010).
- Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. Assays for eukaryotic cell chemotaxis. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).
- Thery, M., Piel, M. Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol. Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255 (2009).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).
- Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5, 13412 (2011).
- Hillborg, H., et al. Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques. Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).
- Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins. Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).
- Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. The leukocyte response to fluid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).
- Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).
- Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).
- Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A.
- Wouters, D., Schubert, U. S. Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices. Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).
- Xia, N., et al. Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation. FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).
- Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template. The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).
