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DOI:

10.3791/50332

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12 de junho de 2013

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1Department of Cardiology, University of Heidelberg

Neste artigo

Resumo

Macrófagos derivados de monócitos são importantes células do sistema imune inato. Aqui, descrevemos um fácil de usar In vitro Modelo para gerar essas células. Utilizando centrifugação de gradiente, o isolamento do grânulo negativo e condições de cultura de células específicas, os macrófagos derivados de monócitos pode ser gerado para estudos fenotípicas e funcionais.

Resumo

Macrófagos derivados de monócitos representam um importante tipo de células do sistema imune inato. Modelos de rato estudar a biologia dos macrófagos sofrem das diferenças fenotípicas e funcionais entre os monócitos-macrófagos murinos e humanos. Portanto, estamos aqui descrever um modelo in vitro para gerar e estudar macrófagos humanos primários. Resumidamente, após a centrifugação do gradiente de densidade de sangue periférico retirados de uma veia do antebraço, os monócitos são isolados a partir de células mononucleares de sangue periférico usando o isolamento esfera magnética negativa. Estes monócitos são então cultivadas durante seis dias sob condições específicas para diferentes tipos de induzir a diferenciação de macrófagos ou de polarização. O modelo é fácil de usar e evita os problemas causados ​​por diferenças entre espécies específicas de rato e de homem. Além disso, é mais próxima do que em condições in vivo, a utilização de linhas de células imortalizadas. Em conclusão, o modelo aqui descrito é adequado para estudar macrophage biologia, identificar mecanismos da doença e novos alvos terapêuticos. Embora não substitui completamente as experiências com animais ou tecidos humanos, obtidos post-mortem, o modelo aqui descrito permite a identificação e a validação dos mecanismos da doença e alvos terapêuticos que podem ser altamente relevante para várias doenças humanas.

Introdução

Macrófagos derivados de monócitos representam um importante componente celular do sistema imune inato e contribuem para muitos processos inflamatórios agudos ou crónicos 1. Os macrófagos desempenham um papel importante em muitas doenças inflamatórias, como a aterosclerose ou cancro 2. Macrófagos apresentam um elevado grau de plasticidade e são capazes de assumir diferentes fenótipos micromilieu dependendo do local 3. Assim, estudar a diferenciação de macrófagos e heterogeneidade é essencial para aumentar o nosso conhecimento da fisiopatologia de muitas doenças e para permitir a identificação de novos alvos terapêuticos e desenvolvimento de novas terapias.

Em muitos casos, os modelos de murino são utilizados para investigar a fisiopatologia de doenças específicas. No entanto, estudando a biologia dos macrófagos utilizando modelos de ratos é acompanhada por várias deficiências: (1) A proporção de número de subconjuntos de leucócitos (ou seja, monócitos e granulócitos), em peripHeral sangue de ratos ou de seres humanos varia de forma significativa, sugerindo diferentes papéis dos monócitos na fisiopatologia murino e humano. (2) Existem diferenças substanciais na expressão gênica entre murino e humano monócitos do sangue periférico, sugerindo diferenças substanciais na sua função durante a saúde ea doença 4. (3) um número de marcadores que são utilizados para identificar os monócitos e macrófagos de murino (F4/80, lyc, etc.) Não existe nas células mielóides humanas, fazendo a transferência dos resultados em modelos do rato para a situação humana bastante difícil.

Assim, a fim de aumentar o nosso conhecimento de diferenciação de macrófagos e heterogeneidade nas doenças humanas, é preciso fazer uso de modelos de trabalho com os macrófagos humanos. Portanto, aqui descrevem um modelo de geração de macrófagos humanos primários, que é fácil de utilizar e permite o estudo dos macrófagos derivados de monócitos humanos in vitro sob várias condições que resultam em diferentes po macrófagotipos larização. Em vários estudos, utilizou-se o modelo in vitro de macrófagos derivados de monócitos humanos primários para analisar a biologia dos macrófagos e a sua relevância potencial para aterosclerose humana 5-7.

Embora não substitui completamente as experiências com animais ou tecidos humanos, obtidos post-mortem, o modelo aqui descrito permite a identificação e a validação dos mecanismos da doença e alvos terapêuticos que podem ser altamente relevante para várias doenças humanas.

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Protocolo

1. Protocolo

  1. Prepara Amortecedores como se segue:
    1. Prepare tampão para isolamento PBMC: "tampão de lavagem" = 0,02% EDTA em PBS (0,5 M utilização EDTA).
    2. Preparar tampão de isolamento de monócitos: "MACS tampão de lavagem" = 0,5% de BSA (250 mg) + EDTA a 2 mM (200 ul) + PBS (50 mL). Degas o buffer.
    3. Preparar tampão de coloração de FACS e armazenamento das células: "tampão FACS" = 10% de FCS em PBS e "tampão de fixação" = 1% de PFA em PBS.
  2. Desenhar a 30 ml de sangue total a partir de uma veia do antebraço. Use EDTA como anticoagulante.
  3. Isolar PBMC (histopaque) como se segue:
    1. Preparar dois tubos estéreis de 50 ml (sem poli-estireno).
    2. Dilui-se o sangue a partir do passo 2 com PBS de 1:1.
    3. Adicionar 25 ml histopaque + 25 ml de sangue total / PBS por tubo. Certifique-se de que histopaque e sangue não se misturam.
    4. Centrifugar a 400 xg durante 30 min à temperatura ambiente, sem travão.
    5. Aspirar plasma e descarte.
    6. Aspirar interface de opaco e pipeta limpa 50 ml banheirae.
    7. Adicionar 20 ml de EDTA 0,02% em PBS.
    8. Centrifugar a 250 xg durante 5 min a 4 ° C.
    9. Elimine o sobrenadante.
    10. Adicionar 10 ml de EDTA 0,02% em PBS.
  4. Contar as células como se segue:
    1. Misturar bem com vórtex durante 10 seg.
    2. Tomar 200 mL suspensão celular + 300 ml 0,02% EDTA em PBS + 500 mL de Trypan azul (200-500 células/10 praças, caso contrário alterar o fator de diluição).
  5. Realizar isolamento negativo de monócitos como se segue:
    1. Centrifugar as células obtidas no passo 3.10, durante 10 min, 120 x g. Elimine o sobrenadante.
    2. Lavar 2x pellet celular por adição de 10 ml de PBS + 0,02% de EDTA e centrifugar durante 10 min, 120 x g.
    3. Adicionar 9 ml de água estéril por 3 segundos, adicionar 1 ml PBS 10X.
    4. Lavar mais uma vez com PBS + 0,02% de EDTA e centrifugar 10 min, 120 x g.
    5. Conte durante a centrifugação.
    6. Diluir em tampão de EasySep a 5 x 10 7 / ml.
    7. Adicionar 50 ul / ml galo enriquecimento de monócitoscauda.
    8. Incubar durante 10 min a 4 ° C.
    9. Contas de vórtice para 30 seg.
    10. Adicionar 50 ul de pérolas / mL.
    11. Incubar durante 5 min a 4 ° C.
    12. Encha com tampão EasySep para completar o volume de 2,5 ml. A solução agora aparece acastanhada.
    13. Coloque em ímã.
    14. Espere 2,5 min à TA. Durante este tempo, as células não monociticas ligados à esfera magnética irá mover-se para a parede do tubo e ficar lá.
    15. Despeje buffer com monócitos não vinculativas em tubo estéril fresco. Esta solução parece esbranquiçada.
    16. Lavar uma vez com PBS + 0,02% de EDTA e centrifugar durante 10 min, 120 x g.
  6. As células da placa em um prato de plástico ou multiparedes placa a uma densidade de 0,5 x 10 6 / cm 2. Adicionar 1 ml de meio de cultura / 1 x 10 6 células.
  7. Células de cultura sob condições de juros para 6-14 dias.
  8. Mudança de mídia depois de 3 dias pela substituição de 50% dos meios de comunicação com a mídia frescos (ver Tabela 1 para detalhes).
  9. Depois de seis dias de colheita de células para isolamento do mRNA, citometria de fluxo, Western blotting, etc.

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Resultados

Usando o protocolo acima descrito, que rotineiramente obter 25,1 x 10 6 ± 2,2 x 10 6 monocytes/100 ml de sangue (média ± erro padrão a partir de 26 experiências independentes, a Figura 1A). Pureza de monócitos, conforme determinado por coloração por citometria de fluxo para CD14 é habitualmente superior a 95% (97,1 ± 0,4%, média ± erro padrão de 3 experiências independentes, Figura 1B). A viabilidade das células de monócitos isolados de fresco, como determinado por...

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Discussão

Macrófagos derivados de monócitos representam o tipo do sistema imune inato de células chave. Eles desempenham um papel importante em muitas doenças inflamatórias, incluindo aterosclerose ou cancro 2. Assim, estudando a biologia dos macrófagos é essencial para aumentar o nosso conhecimento sobre a fisiopatologia de muitas doenças e para permitir o desenvolvimento de novas terapias.

Muitos estudos aplicar modelos de rato com superexpressão ou falta certos genes de interesse. No cas...

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Divulgações

Os autores não têm de divulgar qualquer conflito de interesses.

Agradecimentos

Agradecemos Nadine Wambsganss para uma excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) e em parte por uma doação do Fundo de Inovação FRONTIER (Universidade de Heidelberg) para CAG

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de centrífuga de 50 ml (estéril)Fisher055398
D-PBS (1X), líquido (sem cálcio ou magnésio)Invitrogen14190-250
EDTASigmaT9285
BSASigmaA-8806
FCSInvitrogen
EasySep Kit de enriquecimento de monócitos humanosStemCell Technologies19059
EasySep MagnetStemCell Technologies18000
tubos FACSFisher352008
Macrophage-SFM (1X)Invitrogen12065-074
Penicilina-estreptomicinaSigmaP-4458
Nutridoma-SPRoche11011375001
humano M-CSF 10 μ gPeprotech300-25
Placas de Cultura de Células 6-wellFisher07-200-80

Referências

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