O ventricular líquido cefalorraquidiano (LCR) banha os neuroepiteliais e cerebral células progenitoras corticais durante o desenvolvimento do cérebro no início do embrião. Aqui descrevemos o método desenvolvido para isolar CSF ventricular de embriões de roedores de idades diferentes, a fim de investigar a sua função biológica. Além disso, podemos demonstrar o nosso dissecção explante cerebral cortical e técnica de cultura que permite o crescimento de explantes com volumes mínimos de meio de cultura ou do LCR.
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Artigo de método
Isolamento de fluido cerebrospinal de embriões de roedores para uso com dissecados Cerebral Cortical Explantes
Neste artigo
Resumo
Resumo
A CSF é um fluido complexo, com uma proteoma dinamicamente variáveis ao longo do desenvolvimento e na idade adulta. Durante o desenvolvimento embrionário, a CSF nascente diferencia do líquido amniótico no fechamento do tubo neural anterior. Volume de LCR, então aumenta ao longo do dia subsequentes como as células progenitoras gliais que revestem os ventrículos e plexo coróide gerar CSF. Os contactos embrionárias CSF a superfície apical ventricular, das células estaminais neurais do cérebro e da medula espinal em desenvolvimento. CSF fornece pressão de fluido crucial para a expansão do cérebro em desenvolvimento e distribui crescimento importante promover factores de células progenitoras neurais de uma forma temporal específico. Para investigar a função do LCR, é importante isolar amostras puras de CSF embrionário sem contaminação a partir do sangue ou do tecido em desenvolvimento telencefálica. Aqui, nós descrevemos uma técnica para isolar amostras relativamente puras de ventricular embrionário CSF que podem ser usados parauma vasta gama de ensaios experimentais, incluindo a espectrometria de massa, electroforese de proteínas, e de células e cultura de explantes primários. Demonstramos como dissecar e cultura explantes corticais em membranas porosas de policarbonato para crescer desenvolvimento do tecido cortical com volumes reduzidos de mídia ou CSF. Com este método, as experiências podem ser realizadas utilizando CSF a partir de diferentes idades ou condições para investigar a actividade biológica do proteoma CSF nas células-alvo.
Introdução
A CSF é um fluido complexo que banha o neuroepitélio desenvolvimento 1-6 e fornece 7 pressão essenciais e promover o crescimento pistas para o cérebro em desenvolvimento 8-12. Para o estudo da CSF ao longo do desenvolvimento do cérebro, desenvolvemos técnicas para isolar CSF ventricular de desenvolvimento de embriões de rato ou mouse durante vários estágios de desenvolvimento 6,9. Os métodos anteriores de isolamento incluiu o uso de um vidro de micro-agulha e isolando o CSF utilizando um micro-injector 1,2. O nosso método utiliza uma pipeta de vidro de micro-capilar, cuja ponta foi puxado para criar um ponto de p....
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Protocolo
1. Isolamento embrião / Preparação
Esta técnica pode ser usada para ratinho ou rato. Neste protocolo que demonstram a técnica de coleta de LCR e dissecção explante cortical cerebral com o cérebro de rato embrionário. Vamos comentar sobre eventuais diferenças importantes para ratos contra ratos que existem dentro das técnicas gerais. Para o sistema de teste idade embrionária, E1 é classificado como o dia da ficha para ratos, E0.5 e é classificado como o dia da ficha para os ratos.
- Prepare um prato micro dissecção Sylgard com elastômero de silicone. Elastómero de Silicone Sylgard 184 é fornecido como um componente do líquido de d....
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Resultados
A coleção CSF deve produzir um líquido claro e transparente. Não deve haver qualquer evidência de contaminação do sangue, como foi demonstrado por um fluido tingido vermelho ou amarelo no aspirado e no tubo de Eppendorf. Também deve haver nenhuma evidência de tecido aspirado e no tubo de Eppendorf. Quando o CSF é centrifugado, pode-se igualmente avaliar a CSF microscopicamente para assegurar que não existe contaminação. Se houver sinais de contaminação, o QCA deve ser descartada. De uma ninhada de rato E14.5, se pod.......
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Discussão
O método descrito para a recolha ventricular CSF produziu amostras relativamente puras de CSF embrionário com composição e actividade da proteína estável consistente em uma série de ensaios celulares 9. Com uma técnica boa coleção e tamanho de leitegada de 10 E14.5 ratos, pode-se esperar para coletar 10-15 ul da CSF, e de uma ninhada de ratos E16, pode-se esperar para coletar cerca de 50-90 ul da CSF. Esta técnica minimiza a contaminação a partir de recolha de sangue e de tecidos, por meio de observação cuida.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.
Agradecimentos
Estamos gratos pelo apoio do NIH (números Prêmio R00 NS072192 para MKL, HD029178 para AS.L., e 2 RO1 NS032457 para CAW). MKL é o destinatário de Boston das Crianças Carreira de Desenvolvimento da Irmandade Hospital / Harvard Medical Fellowship Shore School e membro da Fundação Alfred P. Sloan. CAW é um investigador do Instituto Médico Howard Hughes.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente / Material | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| Wiretrop II agulhas capilares | Drummond Científico | # 5-000-2020 | |
| Sylgard | Adesivos Ellsworth | # 184 SIL ELAST kit | |
| Aspirador conjunto de tubos | Sigma | # A5177-5EA | |
| Filtro descartável | Venturi ou farmácia local | não disponível | Filtro de cigarro normal |
| Faca Roundstock oftálmico (15 faca facada grau) | Precision mundo Instruments, Inc. | # 500250 | |
| 35 milímetros de vidro prato de cultura fundo | MatTek Corp | # P35G-1.5-14-C | |
| Platina-irídio fio | Tritech Pesquisa | # PT-9010-010-3FT | |
| Nuclepore Membrana Track-Etch | Whatman | # 09-300-57 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Fisher Scientific | # SH30031.FS | |
| Tesoura Iridectomia | Belas Science Tools | # 15000-02 |
Referências
- Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development. Developmental Biology. 83 (1), 193-200 (1981).
- Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A.
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Reimpressões e permissões
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