Uma técnica simples e confiável para a visualização e quantificação das vias aéreas motilidade cílios e cílios fluxo gerado usando o mouse traquéia é descrito. Esta técnica pode ser modificado para determinar como uma ampla variedade de factores que influenciam a motilidade dos cílios, incluindo agentes farmacológicos, factores genéticos, exposições ambientais e / ou de factores mecânicos, tais como a carga do muco.
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Artigo de método
O método ex vivo para High Resolution Imaging de Motilidade Cilia em Rodent Airway Epithelia
Neste artigo
Resumo
Resumo
Uma técnica ex vivo para a imagem do mouse epitélio das vias aéreas para a análise quantitativa da função dos cílios móveis importante para a introspecção em função de transporte mucociliar foi estabelecida. Recém-colhida rato traquéia é cortado longitudinalmente através do músculo traqueal e montado em uma câmara com paredes rasas em um prato de vidro de fundo. A amostra de traqueia é posicionado ao longo do seu eixo longitudinal para tirar vantagem do músculo traqueal de enrolar longitudinalmente. Isto permite que imagens de movimento ciliar na vista de perfil ao longo de todo o comprimento traqueal. Vídeos em 200 frames / seg são obtidos usando microscopia de contraste de interferência diferencial e uma câmera digital de alta velocidade para permitir a análise quantitativa da frequência do batimento ciliar e de forma de onda ciliar. Com a adição de partículas fluorescentes durante a imagem, o fluxo de fluido gerado pestanas também podem ser determinados. O tempo de protocolo abrange cerca de 30 min, com 5 min para a preparação de câmara, 5-10 min para a amostramontagem e 10-15 minutos para videomicroscopia.
Introdução
Análise da função cílios móveis no epitélio das vias aéreas é experimentalmente importante para a elucidação dos fatores genéticos e ambientais que podem afetar o transporte mucociliar e saúde pulmonar 1. O protocolo simples desenvolvido para a imagem com o mouse epitélio das vias aéreas fornece um método eficiente para interrogar a motilidade dos cílios das vias aéreas em modelos mutantes e nocaute do mouse e exigem apenas conhecimentos básicos de rato dissecação do tecido traqueal e de imagem ex vivo da motilidade dos cílios das vias aéreas, com alta videomicroscopia resolução. Este protocolo foi criado e aperfeiçoado durante uma tela de mutagênese em larga escala do mouse para permitir uma avaliação rápida da função cílios móveis (freqüência de batimento dos cílios, cílios batida forma, o fluxo gerado cílios) em mutantes com doença cardíaca congênita associada heterotaxy 2-5.
As técnicas atuais utilizadas para estudar a motilidade dos cílios das vias aéreas podem ser agrupados em um ou outro do tipo ex vivo aguda ou lontermo ger em abordagens experimentais in vitro. Experimentos agudos incluem a visualização ex vivo de nasais / vias aéreas biópsias escova humanos 6,7 e análise de seções transversais das vias respiratórias simples 8. As aproximações in vitro utilizam várias técnicas de cultura de células para gerar folhas de epitélios ciliados diferenciado tal como em culturas de interface líquido das vias aéreas ou culturas em suspensão de 9-11. No entanto, estas técnicas reciliation epitélios das vias aéreas requerem um investimento muito significativa no tempo de formação e antes de quaisquer células epiteliais ciliadas utilizáveis são produzidos por experimentação (4-6 semanas 9,10). Enquanto a análise ex vivo aguda das vias aéreas de biópsias da escova epiteliais são comumente utilizados em estudos clínicos humanos, este método não pode ser utilizado em estudos de rato, devido à lesão do tecido exacerbada mecânico 12.
A técnica descrita neste protocolo para análise do moustraqueal epitélio das vias aéreas e não é apenas simples de executar, mas não requer habilidades especiais de dissecação, nem qualquer equipamento especializado, além daqueles padrão para imagens por videomicroscopia. Há muitas vantagens para este protocolo simples. Em primeiro lugar, como o rato traqueia colheita tecidual é rápido e fácil de realizar, que permite a avaliação rápida da função dos cílios das vias respiratórias em um grande número de ratinhos. Isto pode incluir a análise aguda dos efeitos a curto prazo de diferentes tratamentos na in vitro. Por outro lado, sendo uma técnica ex vivo, o epitélio das vias respiratórias ciliado permanece ligada a ela subjacente e tecidos de suporte, assim, conservar as vias de sinalização celulares associadas. Portanto, em comparação com reciliated no epitélio das vias respiratórias in vitro, esta preparação é a melhor representação do ambiente natural no tecido in vivo. Em terceiro lugar, este protocolo permite a aquisição de um número de diferentes parâmetros quantitativos que podem fornecer a avaliação objetiva de móveis cílios função. Finalmente, em contraste com outros métodos actuais para a visualização dos cílios das vias aéreas, este protocolo permite a visualização dos cílios, perpendicularmente à direcção batimento ciliar, o que permite ver o perfil dos cílios, que é óptimo para imagens de alta resolução dos batimentos dos cílios e geração de onda de metachronal .
Este protocolo pode ser modificado num certo número de maneiras de lidar com uma vasta gama de necessidades experimentais, tais como o papel de agentes farmacológicos, factores genéticos, exposições ambientais e / ou de factores mecânicos, tais como a carga do muco das vias respiratórias em função dos cílios e geração / manutenção batimento dos cílios das vias aéreas e propagação de ondas metachronal.
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Protocolo
1. Setup reagentes
1.1 Dissection e imagem Médio
L-15, meio de Leibovitz (L15) é suplementado com FBS (10%) e Penicilina-Estreptomicina (100 unidades / ml de penicilina G sódica e 100 ug / ml de sulfato de estreptomicina) é utilizado tanto durante a colheita de amostras de imagens e traqueia.
2. Shallow Walled Assembléia Câmara Cultura
A câmara utilizada para manter o tecido da traqueia é mostrado na Figura 1. O piso da câmara é o vidro ao fundo do poço 35 milímetros prato de cultura. A parte superior e no lado da câmara é gerado pela colocação de um pequeno pedaço de folhas de silicone de 0,3 mm de espessura sobre o prato de vidro. O bordo da folha é cortada para se ajustar o prato de fundo redondo e o centro é ainda cortada para formar uma câmara central raso (ver passos 2.1-2.3). No topo desta montagem, a mm rodada tampa de vidro deslizante 18 é colocado para gerar um recinto adequado para a imagem.
- Cobrir completamente a mm rodada tampa de vidro deslizante 18 com um quadrado de 0,3 milímetros de espessura folhas de silicone.
- Com uma tesoura de dissecção afiadas padrão aparar o excesso de folhas de silicone em torno da borda da lamínula (resultando em uma camada circular de folhas de silicone).
- Com um bisturi afiada cortar e remover uma praça central de folhas de silicone (aproximadamente 10 milímetros quadrados) a partir do meio da lamela coberto (formando assim o topo e as laterais da câmara de imagem).
3. Traquéia Colheita e Preparação
- Eutanásia camundongos de acordo com cuidados com os animais institucional local e usar comitê e / ou diretrizes governamentais e remover traquéia em um plástico 35 milímetros prato de cultura padrão, com bastante L15 mídia para tecido submergir (autores usaram camundongos pouco antes do nascimento em uma gestação de 16,5 dias, através de -nascidos, neonatal e adulto animais 2).
- Remover o tecido associado não traqueia fixada no exterior detraquéia usando dissecção romba.
- Remover a laringe, com um corte transversal imediatamente abaixo da cartilagem cricóide com micro tesouras de dissecação (Figura 2A, linha 1).
- Retire os ramos dos brônquios principais direito e esquerdo com um corte transversal logo acima da carina usando micro tesoura de dissecção (Figura 2A, linha 2).
- Segure cuidadosamente a traquéia com uma pinça fina e lave o lúmen 2-3 vezes com ~ 1 ml da L15 médio banho com um Pipetman P1000 e P1000 dica para limpar o muco e sangue.
- Corte um segmento do anel 3-4 da traquéia através de um corte transversal com micro tesoura de dissecção (Figura 2B, linha 1).
- Corta-se longitudinalmente através do meio do músculo traqueal deste segmento curto traqueia com micro tesouras de dissecação (Figura 2B, linha 2).
- Corta-se longitudinalmente através do centro dos anéis da cartilagem da traqueia com micro tesouras de dissecação (Figura 2C , linha), deixando duas seções de tecido traquéia adequada para a imagem latente (seção única mostrado na Figura 2D).
4. Cilia imagem
- Transferência de segmentos de tecido da traqueia, do lado do lúmen para baixo, para o meio de um prato de vidro de fundo mm 35 cultura com 100-200 mL de meio L-15.
- Para quantificar o fluxo gerado cílios adicionar uma pequena quantidade de microesferas fluorescentes de 0,20 mM para o meio G-15 banhando a amostra de tecido da traqueia (~ 1 x 10 11 partículas / ml ou 20 ul / ml de suspensão de microesferas Fluoresbrite aquosa a 2,5%).
- Coloque a câmara de imagiologia preparado anteriormente (Ver Processo 1-3 acima) no lado superior da amostra de folha de silicone na traqueia para baixo, com a amostra de traqueia localizado no meio da câmara de paredes raso formado pela janela cortada em folhas do silicone (Figura 1 ).
- Com cuidado, empurre para baixo sobre a lamela para assegurar no lugar e remover qualquer excesso de L-15 mídia da bordas usinga ponta P1000 e P1000 Pipetman.
- Monte o fundo de vidro prato de cultura 35 milímetros e amostra traquéia em um microscópio invertido com óptica 100X objetivas e DIC.
- Usando uma câmera de alta velocidade e software de aquisição de filme coletar filmes da motilidade dos cílios em 200 + quadros por segundo ao longo do epitélio traqueal ciliadas do enrolado borda do músculo traqueal (box, E Figura 2D Descritas: Exemplo de imagem estática de filme gravado) (Filme suplementar 1).
- Usando imagens de epifluorescência FITC e uma luz CCD da câmera baixa (Veja lista de equipamentos acima), recolher os filmes do movimento de microesferas fluorescentes em toda a superfície do epitélio traqueal ciliated para permitir a quantificação posterior do fluxo gerado cílios (Filme complementar 2.)
5. Quantificação de Motilidade Cilia
- Carregar filmes imaginadas DIC no pacote de software ImageJ e seguindo a técnica descrita por Iain Drummond 13 usar a ferramenta de linha para desenhar uma linha raster cruzando os cílios batendo. A "corte virtual" desta linha gera um tipo de imagem quimógrafo onde o movimento ciliar em toda a linha gera um padrão de onda. O número de pixels entre cada pico de onda é-lhes medida (um pixel = uma moldura do filme) a partir do qual o número de batimentos por minuto (isto é, Hz), pode então ser calculado.
- Para medir cílios gerado fluxo de carga fluorescentes filmes talão no pacote de software ImageJ, e usar o plugin MTrackJ 14 a controlar manualmente partículas fluorescentes em toda a superfície da traquéia epitélios e deixar o software gerar velocidade talão e direcionalidade para cada grânulo rastreado.
Cuidados devem ser tomados quando se utiliza partículas fluorescentes para quantificar o fluxo como a distância entre os cílios batendo pode influenciar fortemente magnitude de vazão. O movimento conta no Suplementar Movie 2 é um bom exemplo disso. Neste exemplo grânulomovimento é rápido na superfície dos cílios batendo e cai significativamente off para contas mais longe nos meios de comunicação de banho. Para controlar isso, talão traçados só deve ser recolhida a uma distância fixa acima do epitélio ciliar em todas as amostras para permitir comparações corretas a serem feitas. Finalmente, para obter dados representativos do fluxo de fluido, os grânulos devem ser rastreados por tanto tempo quanto possível, é preferível utilizar grânulos faixas que cobrem as células 10 + ciliadas para o cálculo do fluxo de fluido.
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Resultados
Controle cílios das vias aéreas devem ser claramente visíveis e visto a bater de forma coordenada (Filme Suplementar 1; reprodução do filme é retardado até 15% o tempo real), com fluxo perceptível na direção do batimento ciliar (Filme Suplementar 2; reprodução do filme é 100% em tempo real). Quantificação de filmes cílios devem produzir resultados semelhantes ao observado na Figura 3. Recolha de filmes DIC alta velocidade torna possível a quantificação da frequência de ...
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Discussão
Medição da frequência do batimento ciliar (CBF) é relativamente fácil, utilizando objetivos microscópio de alta potência e de hardware de aquisição de imagem rápida 13,15, e explica por que as medições CBF formam a base da maioria dos estudos que investigam a depuração mucociliar durante a saúde ea doença. No entanto, enquanto a CBF medição é essencial para compreender a depuração mucociliar, medição da CBF sozinho ignora a importância fundamental de ambos ciliar fluxo gerado e batimento ciliar forma de onda,...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
O projeto foi financiado pelo NIH conceder U01HL098180 do National Heart, Lung, and Blood Institute. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos seus autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do National Heart, Lung, and Blood Institute e do National Institutes of Health
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Leibovitz' s L-15 Médio | Invitrogen | 21083-027 | Sem vermelho de fenol |
| Soro fetal bovino | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x pinça fina | Roboz | RS-4976 | |
| Tesoura de dissecção | Roboz | RS-5676 | |
| Tesoura de micro dissecação | Roboz | RS-5620 | |
| Bisturi | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 dicas | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm lamínulas de vidro redondas | Fisher Scientific | 430588 | |
| Placas de cultura de plástico de 35 mm | Corning | 430588 | |
| Placas de cultura de 35 mm com fundo de vidro | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Folha de silicone 0.012" (0.3 mm) de espessura | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μ microesferas de carboxilato de Fluoresbrite YG de diâmetro m | Polysciences | 09834-10 | |
| Microscópio invertido, com objetiva de óleo 100x e filtros DIC | A marca Lecia | DMIRE2 | não é crítica. |
| Lâmpada de mercúrio de 100 watts, filtros de excitação/emissão FITC epifluorescentes | A marca Lecia | não é crítica. | |
| Estágio de microscópio Incubadora | Lecia | 11521749 | Não é necessário se a imagem dos cílios à temperatura ambiente |
| Câmera de alta velocidade campo claro | Vision Research | Phantom v4.2 | A marca não é crítica. Deve ser mais rápido que 125 fps |
| Câmera fluorescente de alta velocidade | Hamamatsu | C9100-12 | A marca não é crítica. Deve ser mais rápido que 10 fps |
| Software de análise de filmes | National Institutes of Health | ImageJ com plug-in |
Referências
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Reimpressões e permissões
