Artigo de método

Alto rendimento, extração automatizada de DNA e RNA de amostras clínicas utilizando a Tecnologia TruTip em Robots Liquid Handling comuns

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DOI:

10.3791/50356

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11 de junho de 2013

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1Application Development, Akonni Biosystems, Inc., 2Manufacturing, Akonni Biosystems, Inc., 3Engineering, Akonni Biosystems, Inc., 4Research & Development, Akonni Biosystems, Inc.

Neste artigo

Resumo

TruTip é uma tecnologia de extracção de ácido nucleico simples, onde uma matriz de ligação poroso monolítico é inserida uma ponta de pipeta. Por conseguinte, a preparação da amostra é de formato compatível com os instrumentos de manipulação mais líquidos, e pode ser usado para muitos médio para aplicações clínicas de alto rendimento e tipos de amostras.

Resumo

TruTip é uma tecnologia de extracção de ácido nucleico simples, onde uma matriz de ligação poroso monolítico é inserida uma ponta de pipeta. A geometria do monólito pode ser adaptado para ponteiras específicas que variam de volume de 1,0 a 5,0 ml. A grande porosidade do monólito permite amostras viscosas ou complexas para passar facilmente através dele com contrapressão fluídica mínima. Fluxo bidireccional maximiza o tempo de residência entre o monolito e amostra, e permite grandes volumes de amostra a ser processado dentro de uma única TruTip. Os passos fundamentais, independentemente do volume de amostra, ou de geometria TruTip incluem a lise celular, a ligação para os poros interiores do TruTip monólito de ácido nucleico, embora a lavagem de componentes de amostra não ligados e tampões de lise, e eluindo os ácidos nucleicos purificados e concentrados em um tampão adequado. Os atributos e adaptabilidade de TruTip são demonstrados em três protocolos de processamento de amostras clínicas automatizados usando um epMotion Eppendorf 5070, Hamilton STAR e Starplus robôs de manipulação de líquidos, incluindo o isolamento de RNA a partir de aspirado nasofaríngeo, o isolamento de DNA genómico a partir de sangue total, e de extracção do ADN fetal e de enriquecimento a partir de grandes volumes de plasma materno (respectivamente).

Introdução

Purificação de ácido nucleico, é necessário para os diagnósticos moleculares mais, a pesquisa usar apenas, e aplicações de ciências da vida. Várias abordagens têm emergido desde o tempo de extracções com fenol / clorofórmio, muitos dos quais se baseiam no princípio fundamental da ligação à sílica, na presença de sais caotrópicos um ácido nucleico. O processo de extração foi simplificada e automatizada através do uso de vários formatos e talão de membrana baseados, com filtros de rotação, esferas magnéticas e abordagens afins dominam setor de ciências da vida (ver exemplos em 2-13). Apesar de eficaz, as partículas e as membranas têm limitações conhecidas quando confrontado com matrizes clínicos desafiadores. Por exemplo, as membranas e colunas baseadas em grânulo são compatíveis, têm pequenas dimensões de poros (assim, pressões elevadas de volta), e requerem algum tipo de apoio, a fim de ser processada por um sistema de centrifugação ou de vácuo. As características físicas das membranas e resultam em colunas grânulofluídica resistência significativa, o que limita o tipo de amostras que podem ser processadas de forma eficiente sem obstruir o consumo, e / ou o volume total de amostras (de entrada), que pode ser uni-direccionalmente processados ​​através do percurso de escoamento. Inversamente, as partículas magnéticas deve ser distribuído em toda a amostra por agitação. A necessidade de distribuir homogeneamente as partículas magnéticas dentro de uma solução limita o volume de amostra total de entrada que pode ser processado com consumíveis grânulo mais magnéticas. Atributos amostra clínica (tal como a viscosidade ou a complexidade) pode levar a uma concentração de partículas magnéticas ineficiente do lado de um tubo ou haste. Além disso, as partículas finas de sílica podem desprender das esferas durante o processo de extracção, a perder a sua magnetização e contaminar a amostra final.

A tecnologia TruTip foi desenvolvido para superar algumas dessas limitações de ácidos nucleicos de amostras de processamento e limitações 14. Ao incorporar um monólito poroso dentro de umponteira, fluídico contrapressão é reduzida, o que permite o controle de fluxo de vácuo (ou seja, pipeta de aspiração). Esta característica permite que o processo de extracção e de instrumentação necessária para purificar ácidos nucleicos a partir de tipos de amostra difíceis de ser muito simplificada (Figura 1). A geometria e porosidade do monólito é adaptada para minimizar o entupimento, enquanto que a espessura do monólito proporciona uma capacidade de ligação de ácido nucleico suficiente para volumes de amostra de 1,0 a 5,0 ml. Fluxo bidireccional da amostra, durante a aspiração e distribuição permite tempos de residência prolongados entre o extracto da amostra e o monólito de ligação para recuperação de ácido nucleico e a eluição eficiente e permite que volumes de amostra relativamente grandes a serem processados ​​que exceda a capacidade do volume da ponta da pipeta em si. Nós relatamos anteriormente, o desenvolvimento e aplicação de um procedimento TruTip manual para purificar RNA de gripe a partir de amostras de nasofaringe usando uma única ou multi-canal Rainin pipeta 15. Eficiências de extracção equivalentes, foram obtidas entre automatizado QIAcube e métodos TruTip manuais em 10 6 cópias do gene da gripe A por ml aspirado nasofaríngeo. O objetivo deste estudo foi demonstrar os procedimentos de média e alta taxa de transferência, automatizados TruTip purificação de ácidos nucleicos para aspirado nasofaríngeo (NPA) e outros tipos de amostras clínicas relevantes, utilizando robôs para manipulação de líquidos comumente encontrados em laboratórios clínicos de referência.

Protocolo

Três protocolos automatizados extracção TruTip são descritos e aqui demonstrado: 1) extracção de médio rendimento ARN de ANF num Eppendorf epMotion 5070, 2) de alto rendimento de extracção de ADN genómico a partir de pequenos volumes de sangue total na Hamilton STAR, e 3) isolamento selectivo e enriquecimento do ADN fetal fragmentado a partir de grandes volumes de plasma materno no Starplus Hamilton. Scripts automatizados estão disponíveis a partir Akonni e apenas descritores de programa de alto nível são fornecidas aqui. Os reagentes de extracção e eluição são automaticamente dispensada de calhas de reagentes volumosos para placas de 96 poços por o script automatizado (s) antes das amostras clínicas são processados.

1. Extração automatizada RNA a partir de aspirado nasofaríngeo

O método TruTip o manual descrito anteriormente 15 é agora adaptado para rodar em um epMotion 5070 robô de manipulação de líquidos Eppendorf, usando uma grande matriz TruTip pore incorporado em 1,0 ml Eppendorf tubotte dicas, a 2 ml placa de poço profundo (EUA Scientific), Akonni TruTip reagentes de extracção e NPA como o tipo de amostra. O epMotion 5070 robô de manipulação de líquidos tem capacidade para até 8 dicas simultaneamente, portanto, um protocolo automatizado de base é descrito por oito extrações paralelo. No entanto, até 24 amostras podem ser processadas durante um único programa de uma placa de amostra de 96 poços de poços profundos. Um programa epMotion separado está disponível (e necessária), a fim de processar 16 ou 24 amostras. O protocolo descrito a seguir é de um script automatizado 8 amostra.

Instalação

  1. Trazer amostras nasofaringe para a TA antes de iniciar a extracção.
  2. Dispensar 100 aspirado nasofaríngeo ul mais 150 ul de água livre de nuclease na coluna 1 da placa de amostra (Figura 2A).
  3. Colocar a placa da amostra na posição B1 epMotion sobre a mesa de trabalho (Figura 2B).
  4. Ponteiras lugar, TruTips e 30 ml depressões reagente no respectivo Worktab epMotionposições le (Figura 2B).
  5. Abra o software Eppendorf epBlue, selecione o arquivo Run fornecido pelo Akonni para 8 amostras, e carregar o método clicando no botão Executar na guia RUN.
  6. Em Configurações do sensor de nível, selecione Níveis e dicas, e clique no botão RUN.
  7. Introduza o volume de amostra para o software e clique em Executar.
  8. O script epMotion solicitará que o usuário adicione extração e eluição reagentes para os reservatórios de reagentes localizados na posição B2 na mesa de trabalho. Adicionar os volumes recomendadas de cada reagente para a respectiva calha. Em 8 amostras, os volumes mínimos de reagentes são:
Reagente Volume (ml) Cocho Posição
95% de etanol 3.5 2
Tampão de Lavagem D 9 3
Tampão de Lavagem E 9 4
Elution Buffer A2 1.3 5
Lise e Binding buffer D 11,0 6
  1. De entrada dos volumes de reagentes na Tabela apresentada pelo software epMotion durante uma solicitação do passo 8, acima. O valor de entrada deve reflectir o volume real de tampão dispensado pelo utilizador em cada recipiente de reagente respectivo, e deve ser maior do que ou iguais aos volumes mínimos mencionados acima. Entradas volume inadequado pode resultar em volumes incorrectos entregues pelo hardware epMotion a cada tubo ou poço na placa de 96 poços (s).

Programa Automated

  1. Selecione Executar para iniciar o método automatizado. O script automatizado irá percorrer os seguintes passos sem a intervenção do usuário:
    Amostra de lise e de distribuição de reagentes:
    1. Dispensar 375 uL Tampão de Lise D na coluna 1 e misturar durante 10ciclos (+ apirate dispensar = 1 ciclo). Este passo é iniciado o processo de incubação de lise, enquanto os restantes reagentes são aliquotado.
    2. Distribuir 1,6 ml Wash Buffer D na coluna 2.
    3. Pipetar 1,6 ml de tampão de lavagem e na coluna 3.
    4. Pipetar 50 ul de tampão de eluição A na coluna 4.
    5. Pausa durante 6 minutos para completar a amostra de 10 min de incubação em tampão de lise D.
    6. Adicionar 375 ul de etanol a cada poço na coluna 1, misturando cada amostra com etanol através de 10 ciclos de pipetagem.
    Extração:
    1. Carregar 8 TruTips da posição A2 na mesa de trabalho, e iniciar o processo de extracção descrito na Figura 1.
    2. Aspirar e dispensar amostra / tampão de lise / etanol a partir da coluna 1 da placa de amostra para sete ciclos para o ácido nucleico que se ligam ao TruTip monólito. Embora o fluxo da amostra através do TruTip pode variar (devido a diferenças de viscosidade amostra clinica), a produção de ácido nucleico para estes amostra haviat afetada pela variação de fluxo. Opções para melhorar o fluxo de amostra estão descritas na discussão.
    3. Mover TruTips placa de amostra para a coluna 2, e ciclo de lavagem 5x Tampão D sobre o monólito para remover o tampão de lise residual e a matriz da amostra.
    4. Mover TruTips placa de amostra para a coluna 3, e ciclo de lavagem 5x tampão E sobre o monólito para remover as proteínas e outros contaminantes a partir do ácido nucleico ligado.
    5. Mover TruTips ao vazio reagente posição reservatório 1 (Tabela de trabalho local B2) e do ciclo de 80x (a uma taxa de fluxo rápido), para secar o monolito. É importante secar completamente o TruTip, como solventes residuais presentes nas preparações de ácido nucleico eluidas irá afectar negativamente as enzimas, tais como transcriptase reversa e Taq DNA polimerase.
    6. Mover TruTips a placa de amostra da coluna 4 e no ciclo de 5x tampão A. A eluição do ácido nucleico extraído e purificado é agora em tampão de eluição em coluna de amostra da placa de 4 poços.
    7. Ejetar TruTips no lixo epMotion.
    8. Quando o programa tiver terminado, remover manualmente a placa de amostra do instrumento e transferir o ácido nucleico purificado para novos tubos para o armazenamento a longo prazo ou de posterior utilização. Os usuários avançados epMotion pode adicionar instruções para o arquivo Run para transferir as amostras eluídas em tubos de armazenamento separados ou placas de PCR, se desejar.

O programa de 16 amostras totais repetirá os passos 10,1 por 10.13 usando colunas placa de amostra 5-8. Para o programa de 24 de amostra, as etapas de 10.1 até 10.13 são repetidos 2x usando amostras colunas placa 5-8 e 9-12, respectivamente.

2. 96 poços de extração de DNA genômico de sangue total

UMA ESTRELA Hamilton robô de manipulação de líquidos é utilizado para demonstrar a extracção automática de 96 amostras, simultaneamente, a partir de sangue total. O Hamilton ESTRELA difere do sistema epMotion em que um aquecedor opcional / unidade agitadora disponível sobre o convés, o que é importante para a digestão enzimática de certas clinicamatrizes de cal, tais como sangue total. Porque o sistema pode ser equipado com uma cabeça de pipeta 96 canais, há uma placa de 96 poços dedicado para cada um dos passos TruTip e reagentes.

Instalação

  1. Ligue o instrumento STAR e computador.
  2. Abra o software de controle de execução Hamilton.
  3. Abra o arquivo Run fornecido pelo Akonni para 96 ​​amostras.
  4. Ponto laboratorial para o convés estrela como mostrado na Figura 3.
  5. Dispensar reagentes nas suas calhas respectivas (volumes denotar o mínimo necessário para processar 96 amostras):
Reagente Volume (ml) Cocho Posição
Lise e Binding Buffer de F 75 5
95% de etanol 100 6
Tampão de Lavagem J 175 7
LavarTampão K 175 8
Elution Buffer A2 12 9
Proteinase K (20 mg ml -1) 8 15

6. Deixar as amostras a equilibrar à temperatura ambiente.

7. Colocar os tubos de ensaio nos suportes suporte com a amostra (posição convés 4 na Figura 3). Exemplo de um lugar na parte de trás do suporte da extrema esquerda e mover-se seqüencialmente cada operadora com 96 Amostra final na posição frontal direita.

Programa Automated

  1. Selecione o botão PLAY no canto superior esquerdo da janela de arquivo Executar e digite o número de amostras a ser processados. O script automatizado irá percorrer os seguintes passos sem a intervenção do usuário:
    Amostra de lise e de distribuição de reagentes
    1. Transferir 200 ul de cada tubo de amostra à placa de incubação na posição 14 sobre o eleater / shaker módulo (Figura 3).
    2. Pipetar 80 ul de proteinase K em cada poço de amostra da placa de incubação.
    3. Dispensar 600 mL Tampão de Lise de F em cada poço da placa de incubação.
    4. Misture a solução durante 10 ciclos, e depois incubar durante 20 min a 70 ° C e 500 rpm. Os 70 ° C da temperatura resulta em conjunto um ~ 60 ° C a temperatura da amostra no interior da placa de poços profundos, o que está dentro da gama de actividade de proteinase k. Enquanto as amostras de incubação, o sistema de manuseamento de líquidos continua operacional dispensando reagentes nas suas placas e poços correspondentes:
      • 100 ul de tampão de eluição A em cada poço da placa de poços profundos na posição 13.
      • 800 ul de etanol a cada poço da placa de poços profundos na posição 10.
      • 1,6 ml de tampão de lavagem de K para cada poço da placa de poços profundos na posição 12.
      • 1,6 ml de tampão de lavagem J em cada poço da placa de poços profundos na posição 11.
    5. Depois de 20 minutos de incubação, a mistura da amostra é transferido do prato de incubação para o prato de poços profundos na posição 10, e misturou-se através de 12 ciclos de pipetagem.
    6. Ejetar dicas de reagentes para o caixote do lixo.
      Extração
      Esta parte do processo de gDNA sangue é muito semelhante à gripe epMotion protocolo, com excepção da composição de reagentes de lavagem e os números de ciclos. As pontas Hamilton TruTips são preto, de modo que o fluxo de líquidos através da TruTip não é visível.
    1. Carregar 96 TruTips da posição coberta 3.
    2. Aspirar e dispensar a amostra / tampão de lise / etanol na posição 10 durante 10 ciclos para os ácidos nucleicos se ligam ao TruTip monólito.
    3. Mover TruTips para posicionar 11 e ciclo Wash Buffer J 5x sobre o monólito para remover o tampão de lise residual e a matriz da amostra.
    4. Mover TruTips na posição 12 e ciclo de 5x tampão de lavagem K para remover as proteínas e outros contaminantes a partir do ácido nucleico ligado.
    5. Ciclo da TruTip 40x em alta velocidade para o ar seco.
    6. Mover TruTips a posição 13 e no ciclo de 5x tampão de eluição A2. O ácido nucleico extraído e purificado é agora em tampão de eluição na placa de poços profundos.
    7. Ejetar TruTips no lixo.

Quando o programa tiver terminado, remover a placa de eluição a partir do instrumento e transferir as amostras extraídas aos tubos adequados para armazenamento ou aplicações a jusante.

3. Extração de DNA a partir de amostras de grandes dimensões do volume do plasma

O instrumento Hamilton Starplus é usado para demonstrar um protocolo automatizado para extracção de ADN fetal circulando livremente a partir de 5 ml de plasma materno. O sistema pode suportar Starplus dois ramos do canal de pipeta automatizado, um com 8 x 5 ml de canais e um com 8 x 1 ml de canais. Estas armas podem operar em paralelo para processamento escalonada em lotes de 8 amostras cada. Um TruTip 5 ml é utilizada para a l inicialextracção arge volume, e de 1 ml TruTip é usado para a separação de um tamanho e de uma maior concentração do ácido nucleico extraído.

Set-up

  1. Ligue o instrumento Starplus e computador.
  2. Abra o software de controle de execução Hamilton.
  3. Abra o arquivo Run fornecido pelo Akonni para oito amostras de plasma de grande volume.
  4. Ponto laboratorial para o convés Starplus como mostrado na Figura 4.
  5. Dispensar reagentes nos seus correspondentes reservatórios:
Reagente Volume (ml) Cocho Posição
NC-W1 17 5A
NC-W2 17 5B
CN-W4 21 5C
Proteinase K (20 mg ml -1) 5 6A
EBB 17 6B
EBA2 5 6C
NC-W3 5 6D
NC-B2 5 6E
NC-B3 5 6F
NC-L1 52 7
NC-B1 175 8
  1. Deixar a amostra equilibrar à temperatura ambiente.
  2. Colocar os tubos de ensaio nos suportes suporte com a amostra (posição coberta 3 na Figura 4). Exemplo de um lugar na parte traseira e mover sequencialmente em direção à frente do baralho.

Programa Automated

Devido ao grande volume de amostras de entrada, passos de lise e homogeneização deve ser realizada fora do instrumento Hamilton Starplus num banho de água. Passos requerem a intervenção do utilizador dentro do protocolo automatizado são indicados com um asterisco (*) no beginning da sentença, e negrito.

Amostra de lise e de distribuição de reagentes: A amostra é incubada com proteinase K e tampão de lise para homogeneizar a amostra e libertar o ADN.

  1. Selecione o botão PLAY no canto superior esquerdo da janela Executar arquivo. Introduzir o número de amostras a ser processado, a localização de pontas de pipeta no convés, e a localização da TruTips no convés.
  2. O script automatizado adiciona 615 mL proteinase K, 5 ml de plasma, e 6,2 ml Tampão de Lise CN-L1 para cada 50 ml tubo cônico, e, em seguida, fará uma pausa.
  3. * Remover os tubos cónicos de 50 ml, a partir do convés de exemplo, vortex durante 30 segundos na velocidade máxima, e incubar fora de linha, durante 30 min a 60 ° C em banho-maria ou bloco de aquecimento. Após os tubos cónicos são removidos a partir do convés de Hamilton, RESUMO o script automatizado para prosseguir a distribuição de reagentes nas respectivas placas e poços (Figura 4B e 4C):
    • 2 ml CN-W1 bem com todos os outros na posição 9 da coluna 1.
    • 2 ml NC-W2 para todos os outros bem na posição 9 da coluna 2.
    • 2 ml CN-W4 bem com todos os outros na posição 9 da coluna 3.
    • EBA2 250 ul a cada poço em outra posição 9 colunas 4 e 5.
    • 495 ul CN-B2 a cada outro poço na posição 10 da coluna 1.
    • EBB 1 ml a cada poço na coluna outra posição 2 10.
    • 500 ul CN-W3 bem com todos os outros na posição 10 da coluna 3.
    • 500 ul CN-W4 bem com todos os outros na posição 10 da coluna 4.
    • EBA2 50 ul a cada poço, em outra coluna 10 posição 5.

Porque os canais de 5 ml são demasiado grandes para utilizar poços adjacentes, para cada amostra, o programa de dispensa automatizada reagentes em qualquer outro poço da placa de poços profundos em posição de piso 9. O braço mecânico usado para os canais de 1 ml também requer a utilização de qualquer outro poço em placas de reagentes para a exclusão e concentração reps do protocolo.

Depois de dispensar os reagentes, o programa fará uma pausa.

  1. * Depois de 30 min, 60 ° C de incubação, colocar os tubos cónicos de 50 ml em gelo durante 5 min.
  2. * Retorna os 50 ml tubos cônicos às suas posições originais dentro do porta-rack de amostras na posição convés 4, e retomar o script automatizado.
  3. Adicionar 12 ml de tampão de ligação CN-B1 a cada tubo de amostra e misturar 10x.

Grande volume de extracção: de 5 ml TruTips são utilizados para extrair ADN total a partir do lisado da amostra de plasma.

  1. Pegue cinco TruTips ml da posição 2 para a extração de ácidos nucleicos de grande volume.
  2. Ciclo da amostra mixture15 vezes no tubo de 50 mL cónico, começando na parte inferior do tubo e móvel de 3 mm mais elevada após cada ciclo de pipetagem. Esta etapa liga-se o total de ácidos nucleicos para a TruTip monólito.
  3. Mover TruTips às placas de poços profundos na posição 6 da coluna 1, e cycle 1x em tampão de lavagem CN-W1.
  4. Mover TruTips a posição 9 da coluna 2 e ciclo de lavagem em 1x CN-W2.
  5. Mover TruTips a posição 9 da coluna 3 e no ciclo de lavagem 2x CN-W4.
  6. Mover TruTips a posição 9 da coluna 4 e no ciclo de 40x a alta velocidade para secar da matriz de ligação.
  7. Mover TruTips a posição 9 da coluna 5 e ciclo 10x para eluir os ácidos nucleicos ligados a partir das TruTips 5 ml. Isto é de grande volume de eluição # 1.
  8. Mover TruTips a coluna 6 e repetir o passo com a segunda aliquota de tampão de eluição. Isto é de grande volume de eluição # 2.
  9. Transferência de eluição º 2 na posição 9 coluna 5 combiná-lo com eluição # 1, e descartar as TruTips.

Exclusão e Concentração: O ADN de elevado peso molecular é removido da amostra extraída, e o ADN é isolado remanescente e concentrou-se.

  1. Adicionar eluente combinado a partir do passo 22 para a posição 10 da coluna 1 e homogeneizar 10x.
  2. Pegue 1 ml TruTiMA a partir da posição 13 e ciclo 20x para ligar o ADN de elevado peso molecular para o monolito.
  3. Mover os TruTips para a posição 10 da coluna 2 e ciclo 5x para enxaguar a ponta e remover o ADN de elevado peso molecular. Os TruTips são retidas e colocado de volta na prateleira ponta na posição 13.
  4. Com dicas de reagente de posição 12, adicione 575 ml de tampão de ligação CN-B3 para a amostra na posição 10 coluna 1 e mix de 10x.
  5. Pegar os TruTips a partir do passo 25, o retorno para a posição 10 da coluna 1, e ciclo 20x para ligar o ADN restante a partir da amostra de 1 ml a TruTip.
  6. Mover TruTips para a posição 10 da coluna 4 e no ciclo de lavagem em 1x CN-W3 para remover quaisquer inibidores restantes.
  7. Mova os TruTips para a posição 10 coluna 5 e ciclo de 1x em Wash CN-W4 para enxaguar sais residuais de CN-W3.
  8. Levante TruTips sobre a posição 10 coluna 5 e ar percorrer as dicas 35x para secar o monolito.
  9. Mover TruTips para a posição 10 na coluna 6 e no ciclo de 10x EBA2 para eluir a purificada, tamanho selecçãoted concentrado e de ácido nucleico.
  10. Descarte TruTips.
  11. Transfira a amostra a partir da coluna 6-1,5 ml tubos na posição 11. Amostras extraídas estão prontos para armazenamento ou processamento downstream.

Resultados

Dados de PCR em tempo real para influenza extração de RNA a partir de NPA são mostrados na Figura 5A. A eficiência da extracção do ácido nucleico estimado é semelhante aos resultados obtidos com a versão manual do protocolo 15. Uma resposta linear em média de valores de C T pode ser observada entre 10 4 e 10 6 ml -1 cópias do gene alterado gripe (R 2 = 0,99 e 0,98 para influenza A e B, respectivamente), com desvios padrão da média C t valores inferiores a 1 ciclo. A ausência de contaminação cruzada com o sistema epMotion é demonstrado na Figura 5B, em que 12 amostras positivas NPA contendo 10 6 ml -1 cópias do gene ANF foram intercalados com espaços tampão 12. A média de C t para os controles positivos foi de 30,16 ± 0,14, e todos os espaços em branco tampão foram negativos. O tempo total de processamento da amostra é de 16, 28 e 40 min para 8, 16 e 24 amostras, respectivamente.Porque um aspirado nasofaríngeo clínico típico ou chumaço conterá 10 cópias do gene 7 ml -1 (assumindo 1000 viriões por TCID 50 e 16> 10 4 TCID 50 ml -1 gripe 17), o protocolo epMotion automatizada está prevista para ser eficaz na maioria de espécimes clínicos NPA.

Dada a variedade de testes moleculares realizados em ADN genómico humano, o objectivo primário de extracção de ácido nucleico a partir de sangue total é o de produzir, o ADN genómico sem contaminantes de alto peso molecular. O protocolo automático para 96 amostras é concluída dentro de 1 hora, o que é uma melhoria em relação a outros sistemas automáticos (por exemplo, a Promega MagneSil = 90 min e Qiagen QIAamp DNA Sangue BioRobot sistema MDx = 2,5 horas). Figura 6A mostra os perfis de absorvância no UV / VIS 45 amostras de sangue positivas transformadas simultaneamente com 45 brancos de reagentes sobre o protocolo de Hamilton em estrela, com uma média A Rácio de 1,96 260/280 e uma proporção média de 1,93 260/230. Um A 260/280 proporção entre 1,7-2,0 e uma proporção 260/230> 1,7 são geralmente indicativos de ADN muito pura, isento de sais residuais, proteínas ou solventes, e aceitável para aplicações moleculares mais a jusante. O gel de agarose a 1% na Figura 6B mostra que a gDNA resultante é de elevado peso molecular (> 24 kb), com corte mínima. O rendimento médio de ácido nucleico a partir de todo o conjunto de 45 amostras positivas é de 5,26 ± 0,46 ug de ADN humano por 200 uL de sangue total, com base na Life Technologies Quantifiler Quantificação do ADN humano Kit. Estudos de contaminação cruzada semelhantes àqueles mostrados na Figura 5B foram realizadas com placas de controlo negativo de tampão intercaladas com as amostras positivas e extraída em paralelo, todos os espaços em branco foram novamente negativos por PCR (não mostrado). A purificada gDNA também é adequado para numerosas outras análises baseadas em PCR (não mostrado).

Resultados em tempo real a partir de oito amostras idênticas de uma amostra de plasma materno reunidas processado com o procedimento TruTip grande volume são mostrados na Figura 7. O protocolo completo (incluindo o off-line de proteinase K de incubação) é terminada em cerca de 2,5 h, semelhante ao manual Qiagen Circulação Nucleic Acids Kit (kit de extracção automatizadas não são ainda comparáveis ​​disponíveis). Os valores médios de C T mais de todas as repetições são 34,58 ± 0,66 e 29,76 ± 0,50 para o feto macho (CHY) e o ADN total (CH1), respectivamente, o que demonstra excelente repetibilidade do método de extracção automática. A concentração de ADN fetal no pool de DNA total (em equivalentes do genoma), é calculado com base na comparação de análise de ponto de ajuste de padrões, com a média de ADN fetal resultando% em todas as amostras de 2,8%. A DNA real fetal% para esta amostra é desconhecido, porque as amostras foram recolhidas antes de realizar a extracção. Composição do DNA fetalAs amostras de plasma em não-combinadas extraído utilizando o método TruTip são tipicamente cerca de 1,5 vezes mais elevado comparado com os resultados com um Qiagen Circulação Nucleic Acids Kit (não mostrado).

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Figura 1. O processo de extracção TruTip e fluxo de trabalho, independentemente do sistema de manuseamento de líquidos. Outros passos de preparação de amostra ou de processamento de líquidos pode ser incorporada rotinas automatizadas, dependendo das capacidades do aparelho de manipulação de líquidos específicos e de software.

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Figura 2. (A) Eppendorf epMotion 5070 layout da placa de amostra. (B) Arranjo de reagentes / Consumaveis na mesa de trabalho. amostra A placa pode ser configurado para até 24 amostras (colunas 1, 5 e 9, respectivamente), embora a epMotion só irá processar um máximo de 8 amostras simultaneamente. clique aqui para ver figura maior .

figure-results-3
Figura 3. Hamilton layout de convés ESTRELA para a purificação de DNA genômico de sangue total (sem escala) Baralho posição 1 = Hamilton 1 ml dicas filtradas; Hamilton. 2 = 1 ml dicas não-filtradas, 3 = Akonni / Hamilton de 1 ml LPT dois milímetros TruTips, 4 = entrada de portadores de amostras de sangue (tubos de coleta de sangue ou tubos de microcentrífuga), 5-9 = 290 ml depressões reagentes para Lise F, etanol, solução tampão J, K e Wash Buffer eluição tampão A2, respectivamente, 10 = 96 deep prato bem Binding; 11 = 96 poço profundo Lave J; 12 = 96 poço profundo Lave K; 13 = 96 prato eluição poço profundo; 14 = Hamilton HHS2 aquecedor / agitador com Nunc 96 placa de incubação poço profundo; 15 = 50 ml através de reagente contendo proteinase K. Clique aqui para ver a figura maior .

figure-results-4
Figura 4. Hamilton disposição Starplus convés para a purificação de ADN a partir de amostras de plasma de grande volume (não à escala). O sistema está equipado com canais de 8 x 5 ml e 8 x 1 ml, os canais (não mostrado no esquema da prancha). Baralho Posição 1 = Hamilton 4 ml dicas filtradas, 2 = Akonni / Hamilton de 5 ml TruTips, 3 = amostras de plasma de origem, 4 = 50 ml tubos cônicos, 5 = 120 ml depressões reagente contendo CN-W1, W2 e CN-CN-W4 REAGEnts, ​​6 = calhas reagentes de baixo volume contendo proteinase K, CN-B2, CN-B3, EBA2, EBB e CN-W3 reagentes, 7 = 290 ml através reagente contendo reagente CN-L1; 8 = 290 ml através reagente contendo CN -B1 reagente; 9 = placas de 96 poços profundos para a etapa 1, 10 = 96 placas de poço profundo para a etapa 2, 11 = portadores de amostra para purificada, produto final; 12 = Hamilton 1 ml dicas não filtradas, 13 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 4 TruTips mm. Clique aqui para ver a figura maior .

figure-results-5
Figura 5. (A). Real-time PCR resultados da extração TruTip automatizada de vírus influenza adicionado em aspirado nasofaríngeo (NPA). APN = volume de 100 ul de entrada, o volume de eluição = 50 ul. Os resultados são a média de três e replicamxtractions a partir de 5 NPA fundos distintos (n = 15) por o nível de diluição e de destino da gripe. qPCR foi realizada no sistema LightCycler 480 com condições de ensaio descritas anteriormente 15. (B) Sem contaminação cruzada é detectado quando 12 amostras positivas NPA são intercaladas sem controles de modelo e submetidos a processo de extração automática. Clique aqui para ver a figura maior .

figure-results-6
Figura 6. Resultado da extracção de ADN genómico humana a partir de sangue inteiro a.) Vestígios de UV-visível a partir de 1000 NanoDrop (ThermoFisher) seleccionados aleatoriamente a partir de 10 repetições. B) 1% de gel de agarose de gDNA TruTip purificada. M = Fisher 24 kb Max DNA Ladder. Lanes 1-4 = ~ 100 ng purificada gDNA de quatro aleatoriamente selecionado repetições. Clique aqui para ver a figura maior .

figure-results-7
Figura 7. Em tempo real os resultados da PCR de oito replicar extrações TruTip de livremente circular de DNA de amostras de plasma. Denotados por asteriscos (* ou **) foram extraídos em dias separados. CHY quantifica DNA fetal masculino e CH1 quantifica total de DNA presente (fetal e maternal). qPCR foi realizada num sistema de 480 LightCycler (Roche), com o objectivo de ensaios publicados anteriormente CHY e CH1 18.

Discussão

A simplicidade do conceito TruTip e fluxo de trabalho (Figura 1) torna prontamente adaptados, automatizado, eficiente e eficaz para um número de matrizes de amostras clínicas, os volumes de amostras de entrada, e os sistemas de manuseamento de líquidos. Deve ser reconhecido, contudo, que cada amostra clínica é único, e variará de um para o outro na viscosidade, partículas, muco, os contaminantes da superfície, microbianos e / ou fundos genéticos humanos. Dadas as variações esperadas na composição da amostra clínica e utilizações previstas para um protocolo de preparação da amostra TruTip automatizado, pode ser necessário modificar alguns passos em um procedimento TruTip, a fim de alcançar os resultados desejados para um tipo de amostra específica. Independentemente do tipo de amostra, no entanto, os parâmetros TruTip que normalmente têm o efeito mais significativo sobre a pureza de ácido nucleico e / ou recuperação incluem:

  1. Exemplo de mistura e homogeneização com um tampão de lise (e álcool). Enquanto TruTips ter um revamente grande tamanho dos poros, a homogeneização da amostra e de liquefacção é muito importante para a lise eficiente de células, e os subsequentes passos de ligação ao TruTip monólito. Com um ligado homogénea e bem liquefeito, as amostras podem mover-se através do TruTip com taxas de fluxo mais elevadas, o que reduz o tempo global de processamento da amostra. O grande volume de plasma protocolo demonstra o potencial de usuários para homogeneizar cuidadosamente e liquefazer amostras difíceis (on-line ou off-line), apesar do grande volume de amostra de entrada.
  2. As taxas de fluxo. Caudais inferiores durante ligação de ácido nucleico ou de eluição normalmente resultam em rendimentos mais elevados de ácido nucleico, embora à custa do tempo total de processamento. Taxas de fluxo mais lentas também pode reduzir a extensão de corte de DNA.
  3. O número de ciclos. Número óptimo de aspiração e dispensar ciclos depende do tipo de amostra, o volume total da amostra, e as taxas de fluxo. Passo 1 da Figura 1 é tipicamente o ponto no qual numbe cicloRS (e as taxas de fluxo) pode exigir alguma optimização empírica, com amostras, tais como aspirado nasofaríngeo (Figura 5), que representa um dos lisados ​​mais desafiantes para optimizar devido à gama de viscosidades NPA de diferentes pacientes.
  4. Secagem. Completa secagem da TruTip monólito é imperativo evitar que a partir de solventes orgânicos residuais co-eluindo com a amostra de ácido nucleico purificado e os processos a jusante, ou ensaios de inibição. Porque TruTip não é seca por meio de centrifugação ou filtração sob vácuo, é importante para maximizar tanto a taxa de fluxo e os números dos ciclos durante a etapa de secagem. Às vezes não é uma gotícula de solução de lavagem residual no terminal de TruTip após os ciclos de secagem está completada. Hamilton O robot tem capacidade para desempenhar um "toque ponta" do lado do poço, para libertar a gota, assegurando assim uma eluição livre de solvente. O sistema epMotion não tem esse recurso, mas uma pré-lavagem do terminal TruTip em ellução tampão pode ser programada para obter o mesmo efeito.

Devido à geometria, material da ponta de pipeta, e método de fixação dos braços robóticos de canal são únicos para cada fabricante do instrumento, um constructo TruTip diferente é necessária para cada sistema de manuseamento de líquidos. As dimensões do monólito TruTip (diâmetro, espessura e tamanho de poro) que se correlacionam com a capacidade de ligação de ácido nucleico (e eficiências de eluição), como é esperado para qualquer técnica de extracção em fase sólida. Enquanto grossas (> 4 mm) de matrizes pode ser incorporado em um 1 mL TruTip para aumentar a capacidade de ligação de ácido nucleico para as amostras de grandes volumes e / ou igualar a capacidade de ligação entre os formatos TruTip específicas, existe uma compensação entre a espessura TruTip e taxas de fluxo durante o passo inicial de ligação (na presença de lisados ​​brutos). Assim, é por vezes vantajoso incorporar monólitos de maior diâmetro em pontas de pipetas de maior volume para os passos iniciais de um protocolo automático (por exemplo, </ Em> os 5 ml de Hamilton / Akonni TruTips para extrações de grande volume). Dadas as configurações TruTip específicas ditadas pelos fabricantes de robôs de manipulação de líquidos, no entanto, não necessariamente esperar rendimentos ácidos nucleicos TruTip ser idêntica em todas as plataformas de manuseio de líquidos de diferentes fabricantes, ou em diferentes tamanhos TruTip.

As amostras clínicas (por definição) irá conter quantidades significativas de DNA genómico humano, a menos que eles são adquiridos a partir de locais normalmente estéreis (por exemplo, fluido espinhal cerebral). Por vezes, o DNA genómico humano é desejada (tal como na Figura 6), enquanto que em outras aplicações, o DNA humano representa um fundo genómico indesejado (tal como para a Figura 5). A presença de ADN de fundo não é normalmente problemática contanto que a quantidade total de ácido nucleico na amostra não exceda a capacidade de ligação do monólito, e o ADN do fundo pode servir como um transportador, se o alvo desejado nucleicoácido está presente em quantidades vestigiais. O objectivo do protocolo de extracção de plasma de grande volume (Figura 7) é isolar (fragmentada) de ADN fetal na presença de um excesso de 10-20 vezes de ADN materno, o qual é semelhante ao objectivo a preparação da amostra de teste de doenças infecciosas, excepto que As sequências são altamente congruente e só pode ser distinguido por testes moleculares altamente específica e / ou o tamanho da discriminação. Neste caso, o ADN total em circulação é isolado utilizando 5 ml de uma TruTip, e o ADN fetal de alto peso molecular e de baixo peso molecular são separadas por meio de posterior subsequente ligação e eluição com um 1 ml TruTip alterando as condições do tampão de ligação. Separação por tamanhos e de enriquecimento selectivo de ácidos nucleicos alvo com base na sua ligação e as propriedades de eluição a um monolito de sílica é um modo significativamente diferente da acção que a alcançada por membranas ou colunas de exclusão de tamanho de spin. Tamanho de separação e enriquecimento do DNA microbiano a partir de ADN genómico humano pode ser umccomplished em futuras aplicações via personalizando ligação TruTip e buffers de eluição.

Os protocolos automatizados demonstrado aqui sublinhar a utilidade do próprio TruTip monólito para o processamento de diversas amostras clínicas, e como ele pode ser adaptado para grandes volumes específicos e robôs de manipulação de líquidos. Os métodos simplificados tipicamente resultar em protocolos de extracção mais rápido em comparação com outros sistemas automatizados. A simplicidade da tecnologia TruTip, no entanto, também oferece algumas vantagens de custo para os interessados ​​na compra de um novo sistema de purificação, automatizado ácido nucleico, porque o hardware primário necessário para automatizar procedimentos TruTip é o próprio braço canal pipeta ao invés de barras magnéticas, sistemas de vácuo ou on-board centrífugas. Utilizando placas de reagentes pré-cheias também podem reduzir o espaço e consumíveis necessários, eo dobro do rendimento per prazo. Minimizando o espaço deck com protocolos TruTip também permite que os usuários avançados para integrar a montante ou dprocessos automatizados ownstream com o TruTip. Por exemplo solução easyBlood de Hamilton para fraccionar sangue total podem ser incorporados com o método de extracção TruTip automatizado, o que iria simplificar significativamente os processos de bio-bancárias. Processos pós-extração, como a quantificação de ácidos nucleicos, a normalização, a PCR set-up, ou sequenciamento de DNA também são facilmente integrados com TruTip nas maiores plataformas de manipulação de líquidos.

Divulgações

Os autores são funcionários da Akonni Biosystems, Inc., que produzem materiais utilizados neste artigo.

Acesso gratuito e Produção deste artigo é patrocinado pela Akonni Biosystems, Inc.

Agradecimentos

Partes deste trabalho foram apoiados pelo National Institutes of Health (NIH), sob concessão R 44 AI072784. Agradecemos ao Dr. Kirsten St. George, Sara B. Griesemer, Daryl Lamson e Amy Dean, do Laboratório de Doenças Virais, Wadsworth Center, New York State Departamento de Saúde para virions gripe quantificados e acesso à clinicamente validado influenza em tempo real Os testes de PCR.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagente/Material
Kit de Extração de Influenza TruTip (EPM TruTips)figure-materials-1 Akonni Biosystems, Inc.300-11120
Etanol 95%Acros Organics/ThermoFisher ScientificAC615110040
Acetona 99%Sigma-Aldrich270725-4L
Água tratada com DEPCLife TechnologiesAM9906
Reservatório de reagentes, 30 mlEppendorf960050100
Placa de poços profundos 96/2.000 μlUSA Scientific30502302
epT.I.P.S. Ponteiras com filtro, 1.000 μlEppendorf960050100
Equipamento
Sistema epMotion 5070Eppendorf5070 000.000
Ferramenta de dispensação TM1000-8960001061
Porta-reservatório960002148
Tabela 1. Reagentes e equipamentos para extração automatizada de RNA de NPA.
Reagente/Material
Kit de Extração de gDNA de Sangue TruTip (Hamilton TruTips)figure-materials-2 Akonni Biosystems, Inc.300-20341
Etanol 95%Acros Organics/ThermoFisher ScientificAC615110040
Protease KAMRESCO LLCE195
Porta-ponteiras CO-RE 96 de 1 ml filtradaHamilton Robotics, Inc.235905
Porta-ponteiras CO-RE 96 de 1 ml não filtradaHamilton Robotics, Inc.235904
Balança de reagentes de 50 mlHamilton Robotics, Inc.187297
Placa de poços profundos de 2 mlUSA Scientific1896-2800
Nunc 96 DWP-2 mlThermofisher27874
Balança de reagentesFisher14-222-412
Equipamento
Sistema Hamilton STARHamilton Robotics, Inc.173027
Canais de pipetagem independentes de 1 ml / Braço modularHamilton Robotics, Inc.173081/173050
Cabeçote de 96 canais de 1 mlHamilton Robotics, Inc.199090
Porta-ponteirasHamilton Robotics, Inc.182085
Porta-amostras/InserçõesHamilton Robotics, Inc.173400/182238
Porta-placasHamilton Robotics, Inc.182090
Porta-múltiploHamilton Robotics, Inc.188039
Unidade de agitação e aquecimento HHS2Hamilton Robotics, Inc.199033
Porta-porta-reservatórioHamilton Robotics, Inc.188047
Tabela 2. Reagentes e equipamentos para extração de DNA genômico em 96 poços a partir de sangue total.
Reagente/Material
Kit de Extração de DNA Circulante TruTip R+D (Hamilton TruTips)figure-materials-3 Akonni Biosystems, Inc.Consulte para informações
Etanol 100%Sigma-Aldrich459828-1L
IsopropanolAcros Organics/ThermoFisher ScientificAC327270010
Protease KAMRESCO LLCE195
Ponteiras filtradas de 4 mlHamilton Robotics, Inc.184022
Ponteiras não filtradas de 1 mlHamilton Robotics, Inc.235939
Placas de poços profundos 96USA Scientific1896-2800
Tubos cónicos de 50 mlCorning/ThermoFisher Scientific05-526B
Balanças de reagentes de 50 mlHamilton Robotics, Inc.187297
Balanças de reagentes de 120 mlHamilton Robotics, Inc.182703
Balanças de reagentes de grande volume com 96 posiçõesThermoFisher Scientific14-222-412
Equipamento
Base do Workstation STARplus Autoload / Módulo de deckHamilton Robotics, Inc.173025/190012
Canais de pipetagem independentes de 1 ml / BraçoHamilton Robotics, Inc.173081/173052
Canal independente de 5 ml / Braço modularHamilton Robotics, Inc.184090/173050
Porta-placasHamilton Robotics, Inc.182090
Porta-múltiploHamilton Robotics, Inc.188039
Porta-porta-reservatório para balanças de reagentes de 50 mlHamilton Robotics, Inc.188047
Porta-balança de reagentes de 120 mlHamilton Robotics, Inc.185290
Porta-ponteirasHamilton Robotics, Inc.182085
Porta-tubos de 50 mlHamilton Robotics, Inc.182245
Porta-amostras com 24 posiçõesHamilton Robotics, Inc.173400
Porta-amostras com 32 posiçõesHamilton Robotics, Inc.173410
Tabela 3. Reagentes e equipamentos para extração de DNA de grande volume a partir de plasma.

Referências

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