Identificação baseada em peptídeo de motivos funcionais e seus parceiros de ligação

Resumo

Técnicas para dissecar os mecanismos subjacentes a secreção de HIV-1 Nef em exosomes são descritos. Pequenos peptídeos específicos derivados da proteína Nef e transfecção foram explorados para determinar a estrutura, função e parceiros de ligação da secreção Modificação Região de Nef. Estes procedimentos têm relevância geral em muitos estudos mecanicistas.

Resumo

Péptidos curtos derivados de motivos específicos encontrados em proteínas de comprimento total, no nosso caso, o HIV-1 Nef, não só mantêm a sua função biológica, mas também pode inibir competitivamente a função da proteína de comprimento completo. Um conjunto de 20 péptidos Nef de varrimento, de 20 aminoácidos de comprimento, com cada uma sobreposição de 10 aminoácidos do seu vizinho, foram utilizados para identificar motivos de Nef responsável pela sua indução de apoptose. Os péptidos que contêm estes motivos apoptóticos apoptose induzida em níveis comparáveis ​​aos da proteína Nef de comprimento completo. Um segundo péptido, derivado da região Modificação Secreção (SMR) da Nef, reteve a capacidade de interagir com as proteínas celulares envolvidas na secreção de Nef no exosomes (exNef). Este péptido SMRwt foi usado como o "isco" proteína em experiências de co-imunoprecipitação de isolar as proteínas celulares que se ligam especificamente ao motivo do SMR Nef. A transfecção e o anticorpo de inibição da proteína foi utilizado para destruir fisicamente a aposta interacçãoween Nef e mortalin, uma das proteínas de ligação ao SMR isolado, e o efeito foi medido com um ensaio de secreção exNef baseado fluorescente. A capacidade do peptídeo de SMRwt para superá Nef completo para proteínas celulares que se ligam o motivo SMR, torná-lo o primeiro inibidor da secreção exNef. Assim, empregando as técnicas aqui descritas, que utilizam as propriedades únicas de péptidos curtos derivados de motivos específicos encontrados em proteínas de comprimento completo, pode-se acelerar a identificação de motivos funcionais em proteínas e ao desenvolvimento de inibidores à base de péptidos de funções patogénicos.

Introdução

Com o advento da terapia anti-retroviral, a epidemia de aids no mundo ocidental tem sido abrandado, mas não reduzido, ea propagação do HIV continua a ser um importante problema de saúde em todo o mundo. Com a excepção do marginalmente eficaz RV144 Thai ensaio, vacinas anti-HIV até agora mostraram falta de protecção contra a infecção. Assim, a investigação sobre potenciais alvos terapêuticos adicionais, ainda se justifica.

Junto com depleção de células T CD4, ativação imune generalizada persistente é uma característica da infecção pelo HIV. Esta ativação imune crônica (CIA) leva a um aumento no volume de células, subpopulações linfocitária....

Protocolo

I. Utilização de péptidos curtos, em análise biológica

I.1. Mapeamento Motivos Biologicamente funcional utilizando Peptídeos

1. Tratar as células com os péptidos de digitalização Nef
   1. Obter um conjunto de peptídeos de varredura da região de interesse. Para as nossas experiências, os péptidos 20-mer, com 10 sobreposição de aminoácidos, que abrangem toda a proteína HIV-1 Nef (205 aa) foram obtidas a partir do Programa Reagente de SIDA. Os péptidos são ensaiados individualmente, como se segue:
   2. Adicionam-se 10 ng / ml de péptido no meio de cultura celular.
   3. Adicionar 10 ml de meio de cultura por placa de cultur....

Resultados

Mapeamento Motivos Biologicamente Funcionais utilizando péptidos. Duas regiões foram identificados nas proteínas Nef que induzem a apoptose. Apoptose Peptídeo orientado foi observada (Figura 2), começando com o péptido N50 (AA30-50), atingindo um máximo de N60 (AA40-60) e N70 (aa50-70), e para diminuir os níveis de base de péptido N100 (aa80-100). O principal motivo 1 (M1), pico, centrando-aa50-60, induz> 80% dos níveis de apoptóticos da proteína Nef de comprimento completo. Um segun.......

Discussão

A compreensão dos mecanismos subjacentes à capacidade da Nef manipular o caminho de tráfico exosomal será útil em inibidores da secreção exNef novos engenharia. A inibição da secreção exNef deve diminuir a depleção de células T CD4 e CIA que patogênese unidade HIV / AIDS. Para atingir este objetivo, temos desenvolvido uma série de novos reagentes e metodologias que nos permitiu analisar a genética da secreção exNef, e começar a determinar as proteínas celulares envolvidas. Esta abordagem também levou ao desenvolvimento .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Conjunto de peptídeos de 20mer com sobreposição de 10 aminoácidos	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	4641
TUNEL Assay	Roche	11 684 809 910
Chariot Protein Delivery Reagent	Active Motif	30100
Tecan GENEios fluorímetro	(Tecan Group, Suíça)
Placa de microtitulação preta de 96 poços	Corning	3792
anti-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	A2220
Dynabeads Protein G contas magnéticas	Invitrogen	100.03D
MagnaSphere Technology Suporte de Separação Magnética (duas posições)	Promega Corp., Madison, WI	Z5332
C-18 ZipTip	Millipore	ZTC18S096	Resina C18 (0,6 μ l ou 0,2 μ l volumes de leito). Oligonucleotídeos ou pequenos (< 50 kDa) proteínas/peptídeos em solução aquosa
MALDI TOF/TOF	Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF