Análise de co-cultura da Relação de proteínas extracelulares que afetam secreção de insulina por células beta pancreáticas se

Resumo

Interações de proteínas intracelulares são determinantes importantes da função das células beta no pâncreas. Detalhado aqui é um método adaptado a partir de um modelo de co-cultura de synaptogenesis-para investigar como as proteínas transmembrana específicos influenciar a secreção de insulina. As células HEK293 transfectadas expressam as proteínas de interesse, células beta não precisa ser transfectadas directamente ou de outro modo perturbado.

Resumo

Interações entre proteínas de superfície celular ajudar a coordenar a função das células vizinhas. Células beta do pâncreas são agrupados dentro de ilhotas pancreáticas e agir de forma coordenada para manter a homeostase da glicose. Está se tornando cada vez mais claro que as interações entre proteínas transmembrana nas superfícies de células beta adjacentes são importantes determinantes da função das células beta.

Elucidação dos papéis particulares interações transcelulares por estudos knockdown, nocaute ou superexpressão em células beta cultura ou in vivo necessita de perturbação direta de mRNA e expressão da proteína, potencialmente afetando a saúde das células beta e / ou função de maneiras que poderiam confundir análises dos efeitos de interacções específicas. Estas abordagens também alterar os níveis dos domínios intracelulares das proteínas alvo e podem evitar os efeitos devido às interacções entre as proteínas no interior da mesma membrana da célula para ser disdiferenciadas das efeitos das interacções transcelulares.

Aqui, um método para a determinação do efeito de interacções específicas transcelular na capacidade de segregar insulina e capacidade de resposta das células beta é apresentado. Este método aplica-se a linhas de células-beta, tais como células INS-1, e para as células beta primárias dissociadas. Baseia-se em modelos de co-cultura desenvolvidas por neurobiólogos, que descobriu que a exposição de neurônios cultivados às proteínas neuronais específicos expressos em HEK293 (ou COS) camadas de células identificadas proteínas importantes para a condução de formação de sinapses. Dadas as semelhanças entre a maquinaria de secreção das sinapses neuronais e das células beta, que argumentou que a maturação funcional das células beta pode ser conduzido por interações transcelulares semelhantes. Foi desenvolvido um sistema em que as células beta são cultivadas sobre uma camada de células HEK293 expressando uma proteína de interesse. Neste modelo, o citoplasma da célula beta é tocada enquanto extracelular da proteína-proteína interactions são manipulados. Embora o foco aqui primariamente em estudos de glicose estimulada a secreção de insulina, outros processos podem ser analisados, por exemplo, as alterações na expressão do gene, como determinado por imunotransf erência ou qPCR.

Introdução

Descrevemos aqui um método para facilitar as investigações de como os domínios extracelulares de proteínas transmembrana específicos afetam a secreção de insulina. O método sondas os efeitos das interacções da proteína de interesse com proteínas (ou possivelmente de outras moléculas), na superfície das células beta do pâncreas. O método permite investigações de como as proteínas da superfície celular, expressas por células beta ou por outras células vizinhas (por exemplo, células endoteliais, neurónios, células alfa pancreáticas) afectam a função das células beta através de interacções transcelulares (isto é, através de interacções com os parceiros ....

Protocolo

1. A transfecção de HEK293 Camada

1. Prepara HEK293 meio celular por adição a 500 ml de frascos de meio DMEM (com 4,5 g / ml de glucose e de vermelho de fenol e sem glutamina): 50 ml de FBS, 5 mL de 100X solução de estreptomicina penicilina /, 5 ml de solução de L-glutamina e 500 100x anfotericina ul B.
2. Placa para células HEK293 em uma placa de 24 poços utilizando 0,5 ml de meio por poço HEK293. Assegure-se que as células são distribuídos uniformemente em toda a parte inferior da placa.
3. Quando as células HEK293 chegar a 100% de confluência, transfecção com 0,8 ug do plasmídeo que codifica a proteína de interesse (inserido num vector de exp....

Resultados

Utilizando o método descrito aqui, testámos o efeito de diferentes variantes do neuroliguinas proteína na secreção de insulina. Isto complementa a obra publicada a investigar o efeito da neuroliguinas-2 em função das células beta ^10. Figura 2, por exemplo, descreve os resultados obtidos a partir coculturing INS-1 células beta com células HEK293 transfectadas para expressar uma isoforma neuroliguinas referido aqui como NL- X. Esta experiência foi concebida para testar a hipótese de que NL-X se.......

Discussão

O método de co-cultura aqui descrito fornece um meio eficaz para determinar a importância fisiológica das proteínas beta da superfície da célula, transmembranares específicos, e, especificamente, dos seus domínios extracelulares. Por cultura de células beta (ou células de insulinoma, tais como as células INS-1 utilizados aqui), em contacto com células HEK293 que indica uma proteína de interesse sobre a superfície celular, as experiências podem ser concebidas para determinar os efeitos da extracelulares interacções prote.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
pcDNA 3.3 vetor / espinha dorsal	Invitrogen	K830001
Lipofectamine 2000	Invitrogen	18324012
DMEM	Mediatech	45001-312
Solução de caneta / estreptococos	Mediatech	45001-652-1
Anfotericina B	Mediatech	45001-808-1 / 30
RPMI-1640	Mediatech	45001-404
D-PBS	Mediatech	45001-434
Piruvato de Sódio	Mediatech	45001-710-1
2-Mercapt– thanol	Invitrogen	21985023
Cell stripper	Mediatech	45000-668
T75 Frasco	BD	1368065
16% Paraformaldeído	Microscopia Eletrônica Ciências	50980487
10x PBS	Mediatech	45001-130
Soro bovino fetal	Mediatech	MT35010CV
Amortecedor	RIPA Sigma	I5879-100MG
	Sigma	R0278

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