A proteína de ligação ao DNA de células famintas (SAD) desempenha um papel crucial no combate ao stress bacteriana. Este artigo discute a purificação da E. coli Dps eo protocolo para um In vitro Ensaio demonstrando proteção Dps mediada por DNA da degradação pelas espécies reativas de oxigênio.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
O estresse oxidativo é um subproduto inevitável da vida aeróbica. Oxigênio molecular é essencial para o metabolismo terrestre, mas também participa em muitas reações prejudiciais dentro de organismos vivos. A combinação do metabolismo aeróbio e de ferro, que é outro composto vital para a vida, é suficiente para produzir radicais com a química de Fenton e degradar os componentes celulares. Degradação do DNA é sem dúvida o processo mais prejudicial envolvendo radicais intracelulares, como reparo de DNA está longe de ser trivial. O ensaio apresentado neste artigo oferece uma técnica quantitativa para medir e visualizar o efeito de as moléculas e enzimas sobre os danos de DNA mediada por radicais.
O ensaio de proteção DNA é uma ferramenta simples, rápido e robusto para a caracterização in vitro das propriedades protetoras das proteínas ou produtos químicos. Isto envolve a exposição do ADN a uma reacção de oxidação prejudicial e adicionando várias concentrações do composto de interesse. A redução ou o aumento de danos no ADN, como uma função da concentração do composto é então visualizada utilizando electroforese em gel. Neste artigo, demonstrar a técnica do ensaio de protecção de DNA medindo as propriedades de protecção da proteína de ligação de ADN a partir de células de privação (SAD). Dps é uma mini-ferritina, que é utilizado por mais de 300 espécies bacterianas para combater poderosamente agressões ambientais. Aqui apresentamos o protocolo de purificação Dps e as condições de ensaio optimizado para avaliar a proteção do DNA por Dps.
Introdução
Os organismos aeróbios deve constantemente competir com as espécies de oxigénio reactivas que podem danificar o DNA, bem como outras macromoléculas biológicas importantes. Uma ferramenta potente para neutralizar os efeitos tóxicos do dano oxidativo é a proteína de ligação de ADN a partir de células de privação (SAD). Desde a sua descoberta, em 1992, a partir de fome E. coli, uma cultura, Dps foi identificado em mais de 300 espécies de bactérias e 2 arqueobactérias. Regulação positiva maciça de Dps durante a fase estacionária torna a proteína nucleoid associada mais alta expressão de E. coli em condições de fome 3, 4. Além disso, tem sido mostrado Dps para preservar tanto a viabilidade bacteriana e da integridade do ADN durante muitos várias tensões, incluindo a fome, a elevada concentração de ferro, a exposição à luz UV, choque térmico, e do stress oxidativo 5, 6.
Estruturalmente, Dps de auto-associados em um complexo estável homo-oligoméricas de 12 monômeros, which montar em uma concha vazia esférica. A ~ 4,5 nm de largura cavidade interna é acessível ao solvente através dos poros, que permitem a passagem de moléculas pequenas 7 o exterior, e que pode sequestrar metais, tais como ferro mineralizados 8. O efeito protetor do Dps deriva das suas diversas atividades bioquímicas, que incluem DNA não específico de ligação 1, atividade ferroxidase e armazenamento de ferro 8.
Estudo detalhado das atividades bioquímicas benéficas Dps requer primeiro a sua purificação. Dps purificação é um procedimento elaborado, como PD devem ser separadas não apenas a partir de outras proteínas, mas também a partir de qualquer DNA ligado 7. O nosso processo de purificação optimizado utiliza várias técnicas comuns, que consiste em duas colunas de permuta iónica e um passo de precipitação com sulfato de amónio. Várias trocas de buffer são necessários, como Dps altamente concentrado pode precipitar para fora da solução em condições de pouca sal. Uma vez que a proteína foi purificada Dps, Pode ser aplicada a ensaios que medem directamente a sua actividade ferroxidase 8, estequiometria de ligação de ADN 9, e os mecanismos de ligação do ferro 10. Purificados Dps também tem outras aplicações potenciais. A estrutura esférica oca estável de Dps tem sido utilizado como andaime para armazenar partículas hidrofóbicas da proteína dentro da cavidade 11 e mesmo como uma câmara de reacção para sintetizar novas nanopartículas magnéticas 12.
A capacidade de proteção de Dps para mediar danos devido a espécies reativas de oxigênio pode ser clara e diretamente demonstrado usando o ensaio de proteção DNA 13, 14. Neste procedimento in vitro, as espécies de radicais são produzidos quando o ferro catalisa H 2 O 2 a degradação química de Fenton. Estes radicais danificar directamente o ADN presente na reacção e pode degradar completamente em concentrações elevadas. Duas atividades principais Dps pode tanto contrariar diretamente os efeitos da Fenta produção do radical a-mediada. Dps reduz a concentração de ferro catalítico da mineralização, o consumo do peróxido de hidrogénio disponível no processo. Além disso, a ligação ao DNA Dps potencialmente pode protegê-lo fisicamente dos danos dos radicais e condensa-lo em um volume menor com menos área de superfície reativa. A combinação destas duas propriedades faz com que o ensaio de protecção de DNA adequado para a finalidade de medir a actividade protectora Dps.
O ensaio de protecção de ADN é bastante versátil e pode ser usado para uma variedade de aplicações para além Dps caracterização. Os danos dos radicais é uma forma comum de estresse em células, e muitas proteínas e substâncias químicas diferentes são usados para combatê-la. O princípio geral do ensaio, utilizando-se a integridade do DNA como um marcador para os danos dos radicais, pode ser usado em combinação com quase qualquer reacção de produção de radicais livres ou agente de neutralização. Entre outros, o ensaio tem sido usado com sucesso para determinar as propriedades anti-oxidantesde K. extrato paniculata para uso na indústria de alimentos 15, para caracterizar os efeitos do ácido úrico em hidroxila mediação dano 16, e para ganhar novos insights sobre a função da pele proteínas reguladoras da transcrição 17.
Apesar dos inúmeros usos do ensaio nos trabalhos publicados, descobrimos que muitos optimização e foram necessários passos de resolução, o que torna a criação de ensaio pela primeira vez um processo desnecessariamente trabalhoso para muitos investigadores. O protocolo que apresentamos neste artigo tem como objetivo eliminar essa barreira para a entrada.
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Protocolo
1. Dps Expressão e purificação
Obtenção de proteína de alta pureza é um primeiro passo essencial para o ensaio de protecção de ADN. A purificação da proteína pode ser realizada Dps em 4 a 5 dias.
- Transformar uma estirpe de protease deficiente de E. coli (tal como BL21 (DE3) pLysS), com um vector pET (por exemplo, pET17) na qual a sequência de codificação de proteína Dps foi clonado.
- Streak as células transformadas para fora em Caldo (LB) ágar Luria contendo antibióticos apropriados (como ampicilina e cloranfenicol para os exemplos fornecidos em 1.1). Incubar as placas durante a noite a 37 ° C.
- Inocule uma colónia isolada a partir da placa em 30 ml de meio LB contendo antibióticos apropriados. Incubar durante a noite a 37 ° C enquanto agitando a 200-250 rpm.
- Inocular 2 x 1 L de meio LB contendo antibióticos adequados com 10 ml cada uma da cultura durante a noite. Crescer a 37 ° C, sob agitação, a DO600 de aproximadamente 0,6. (Cultivo de células mais elevada aumenta o rendimento de proteína OD, sensivelmente sem comprometer a pureza do produto final.) Induzir a expressão de Dps pela adição de IPTG para uma concentração de 0,3 mM e incuba-se a 37 ° C durante 3-4 horas, com agitação.
- Colheita de células por centrifugação a 6000 xg durante 15 min. Voltar a suspender as pelotas de células em 7,5 ml de DEAE tampão A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 0,1 mM) por L de cultura celular induzida. As amostras podem ser congeladas em azoto líquido e armazenadas a -80 ° C, se se desejar. O processo pode então ser continuada por descongelamento das amostras num banho de água a 4 ° C.
- Adicionar uma mistura de inibidores de protease (tais como os inibidores da protease Calbiochem Conjunto III, em 0.167 mL por ml de suspensão de células) para a suspensão de células para evitar a degradação de Dps overexpressed.
- Prepare extrato livre de células utilizando uma prensa francesa. Primeiro a imprensa francesa, com 20 ml DEAE tampão A (se estiver usando um modelo de fluxo contínuo), então disrupt a amostra duas vezes a 20 kpsi. Centrifuga-se o ligado a 30.000 x g durante 35 min a 4 ° C para clarificar as partículas insolúveis, e guardar o sobrenadante. O sobrenadante pode então ser congelados usando azoto líquido e armazenadas a -80 ° C, se se desejar.
- Equilibrar a coluna de 30 ml de DEAE Sepharose CL-6B DEAE com Tampão A, utilizando um FPLC. Executar tampão através da coluna a 1-2 ml / min, com uma pressão máxima de 0,2 MPa ao longo do fundo. Carregar o extracto isento de células para a coluna, e começa a receber o fluxo através de uma vez que o sinal de OD 280 começa a subir acima da linha de base. Lava-se a coluna com DEAE Tampão A até que o valor de DO 280 retorna à linha de base, enquanto continuamente recolhendo o escoamento. O fluxo através deve conter a maior parte da proteína de Dps, isenta de ADN ligado. Lava-se a coluna com 100% de tampão B (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 1 M, EDTA 0,1 mM). Este fluido contém complexos Dps-DNA, bem como outras proteínas e pode ser descartada.
- Remover anúnciocional proteínas contaminantes através de precipitação com sulfato de amónio. Determinar o volume de fluxo através reunidas. Lentamente (durante um período de 10-20 minutos) adicionar sulfato de amónio de pequeno grão seco a 62% de saturação (390 mg por ml de solução), a 4 ° C, enquanto se agitava bem. Agita-se a mistura durante um adicional de 20-30 minutos após a adição da última porção de sulfato de amónio para assegurar o equilíbrio completo. Dps permanecerá solúvel, enquanto que as proteínas contaminantes irá precipitar para fora da solução.
- Remover as proteínas precipitadas por centrifugação a 20.000 xg durante 30 min a 4 ° C e guardar o sobrenadante.
- Lentamente, adicionar uma mg de sulfato de amónio adicional por 227 ml de sobrenadante para atingir 94% de saturação e agitar durante 20-30 minutos para garantir o equilíbrio completo. Dps precipita nesta concentração elevada de sal e pode ser recolhido por centrifugação a 20.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Dps estará na pelete eo sobrenadante pode ser descartado. O sedimento pode ser armazenada a -80 ° C, se desired.
- Ressuspender o DPS contendo sedimento em tampão de ressuspensão (50 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 0,1 mM). Ajustar o volume da amostra de 2,5 ml.
- Tampão de troca para remover o sulfato de amónio, utilizando uma coluna de filtração em gel PD-10. Equilibrar o leito de gel com 25 ml de tampão de ressuspensão. Aplique a 2,5 ml de amostra Dps para o topo da coluna PD-10 e deixe de molho dentro Descarte o flow-through. Recolhe Dps por eluição com 3,5 ml de tampão de ressuspensão.
- Centrifuga-se o tampão permutado amostra a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C para remover todos os componentes insolúveis, e diluir com 6-10 ml de tampão de diluição (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, EDTA 0,1 mM), para assegurar que o concentração de sal é baixo o suficiente para Dps de se ligar à coluna Sepharose SP. Particularmente as amostras concentradas de Dps pode tornar-se menos solúvel por diluição para um tampão de menor sal, como evidenciado pela turvação do líquido, mas pode ser completamente ressolubilizado por meio da adição de uma pequena amount de solução de NaCl a 5 M (um adicional de 10-20 mM).
- Equilibrar a coluna de fluxo de 30 ml de SP Sepharose Fast Food SP com tampão A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM). Executar tampão através da coluna a 1,5-2 ml / min, com um limite de pressão de 0,3 MPa ao longo do fundo. Carregar a amostra sobre a coluna. Lavar com SP tampão A até o OD 280 trace retorna à linha de base, e descartar o flow-through. Executar um gradiente linear de 150 ml de 0 a 100% de tampão B, enquanto recolhendo fracções de 2 ml. Dps vai eluir em um pico acentuado em torno de 50% B, embora a variação de 10% é possível.
- Continuar as fracções de eluição em um gel SDS-PAGE 15%, e para verificar a contaminação de ADN medindo a razão OD 260 / OD 280 utilizando um espectrofotómetro. O gel só deve mostrar uma banda em torno de 19 kDa, eo OD 260 / OD 280 é normalmente em torno de 0,7. Reunir as frações mais puras PD. Usar uma unidade de filtro de centrífuga (tais como a unidade de ultrafiltração Amicon), com uma10K de peso molecular cut-off para concentrar as Dps e trocá-lo para um tampão de armazenamento (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 50 mM). Alíquota da Dps purificados e congelamento em nitrogênio líquido para armazenamento a -80 ° C.
2. Protection Assay ADN
O ensaio envolve várias etapas sensíveis ao tempo e deve ser cronometrado para o segundo para obter resultados reprodutíveis. Muitos ingredientes e passos de pipetagem estão envolvidos para uma mesa de pipetagem (ver Tabela 1), é aconselhável manter o controle de etapas e volumes. O tempo total necessário para o ensaio é de não mais do que 3 horas.
- Medir 30 ml de água em um tubo vedado; descarregar a água, com N2 durante 10 min (utilizando duas agulhas de seringa, uma no líquido, um acima dela) para remover o oxigénio a partir da solução. Adicionar 0,0168 g de FeSO 4 • 7H 2 O para a água para obter uma solução de estoque de 2 mM. Selar o frasco e lave com nitrogênio por 5 min mais, em seguida, misture. A solução deve serclaro, se qualquer indício de amarelo é detectável, preparar uma nova solução de ferro.
- Adicione uma solução 100 mM de H 2 O 2 (10,87 mL de 9.2MH 2 O 2 em 1 ml de água), manter em gelo e protegida da luz por envolvimento em folha de alumínio. Utilize apenas por cerca de 1-2 horas após a preparação devido à deterioração espontânea. O estoque de peróxido de hidrogénio está igualmente sujeita a desagregação, que pode ser parcialmente melhorada por armazenamento adequada (no escuro, a 4 ° C). Controlo regular da concentração acionário, medindo os 240 OD são recomendados.
- Descongelar uma alíquota de Dps rapidamente purificada num banho de água à temperatura ambiente, e manter em gelo. Centrifugar por 10 segundos a 4.000 xg em um table top picocentrifuge aos agregados precipitar. Medir a concentração após a centrifugação utilizando um espectrofotómetro (OD 280 = 1,547 indica uma concentração de 100 uM de monómeros Dps).
- Diluir DNA linear de estoque-alta concentração usando tampão de reação 12x (1M de MOPS-KOH pH 7,0, 1 M de NaCl) para uma concentração de 100 ng / mL. ADN linear é usada para tornar mais fácil quantificação, mas o DNA de plasmídeo pode ser utilizado também.
- Pipetar 1 mL da mistura de ADN-tampão para um tubo de PCR. Adicionar água suficiente para a reacção de modo que o volume final da reacção (menos de SDS) será de 12 ul. Este valor deve ser calculado com antecedência usando a tabela pipetagem. Adicionar Dps a uma concentração de 3 uM dodecamer final. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente para permitir Dps para se ligar ao DNA.
- Adicionar suficiente solução 2 mM de FeSO4 para atingir a concentração desejada. Uma experiência típica utiliza uma gama de concentrações de 0 a 1 mM de FeSO4. Concentrações mais elevadas irão causar mais extensa degradação de DNA, mas pode também levar à formação de férrico precipita na mistura de reacção. Rapidamente adicionar 1 mL da solução de 100 mM de H 2 O 2 (a uma concentração final de 10 mM), e incubar à temperatura ambiente durante 5 min para permitir que a FentonReação de degradação mediada por acontecer.
- Adicionar 0,8 mL de 20% de SDS (dodecilsulfato de sódio). Misturar e incubar a 85 ° C durante 5 minutos para interromper os complexos de ADN-Dps. A SDS desestabiliza o complexo Dps-DNA e evita deslocamentos indesejados gel para o DNA, o que melhora a facilidade de quantificação. Um passo opcional é parar a reacção por cataliticamente degradar o peróxido de hidrogénio em produtos não-tóxicos. Para as condições descritas no presente protocolo, este passo não é necessária para obter uma ampla gama de degradação de ADN.
- Incubar em gelo durante 1 min, adicionar corante de carga e carregar num gel de agarose. Executar o gel, e mancha de ADN, utilizando brometo de etídio. O gel deve ser coradas após electroforese, em vez de antes da electroforese, para evitar a SDS de interferir com a distribuição do brometo de etídio no gel.
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Resultados
O processo de purificação para Dps descritos aqui é muito reprodutível. Dps de purificação de acordo com o protocolo descrito, utilizando-se 2 L de E. cultura coli como um ponto de partida, normalmente produzir 2,5 ml de proteína contendo Dps 12 em concentrações entre 5 e 12 mM. Tempos de indução mais longas (4 horas) parecem reduzir essa variabilidade. Pureza da proteína é consistentemente superior a 99%, como evidenciado por SDS-PAGE, os géis (Figura 1). O nível de contami...
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Discussão
O processo de purificação de Dps, conforme descrito neste artigo é muito robusto. Pureza tem sido consistentemente alta (> 99%), não aparecem outras proteínas em gel de SDS-PAGE como bandas visíveis. Apesar disso, alguns lotes de Dps purificados parecem ter actividade de nuclease, tal como evidenciado pela degradação parcial de ADN quando incubadas com concentrações muito elevadas de Dps. Isto pode indicar a presença de ADNases altamente activos em baixa concentração que não fomos capazes de remover por meio de purif...
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Divulgações
Não temos nada a divulgar.
Agradecimentos
Somos gratos a Michela de Martino, Wilfred R. Hagen, e Kourosh Honarmand Ebrahimi para discussões úteis. Este trabalho foi apoiado por fundos start-up da Universidade Delft de Tecnologia.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| BL21 (DE3) pLysS células competentes | Promega | L1195 | |
| pET-17b DNA | EMD-Millipore | 69663-3 | |
| LB caldo em pó | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Sal de ampicilina sódica | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| Cloranfenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| HEPES | BDH | 441476L | |
| Hidróxido de potássio | Merck | 105033 | |
| Cloreto de sódio | VWR | 443824T | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Conjunto de coquetel inibidor de protease III | EMD-Millipore | 539134 | |
| DEAE-Sepharose | Sigma-Aldrich | DFF100 | |
| Sulfato de amônio | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| PD-10 Colunas de dessalinização | GE Healthcare LS | 17-0851-01 | |
| SP-Sepharose | Sigma-Aldrich | S1799 | |
| Amicon Ultra Centr. Filtro (10K MWCO) | Millipore | UFC901024 | |
| Sulfato Ferroso heptahidratado | Sigma-Aldrich | F8048 | |
| Solução de peróxido de hidrogênio | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| MOPS | Calbiochem | Solução 475898 | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Brometo de etídio | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Incubadora estática | Hettich | INE500 | |
| Shaking Incubator | New Brunswick Sc. | Inova 44 | |
| Centrífuga refrigerada | Beckman Coulter | Avanti J-E | |
| Centrífuga de mesa | Eppendorf | 5424 | |
| Disruptor de células | Constant Systems Ltd. | TS2 / 40 / AA / AA | |
| Purificador FPLC | General Electric | AKTA | |
| Frascos herméticos | Cole-Parmer | EW-08918-85 | |
| Agulhas de seringa | BD | 305128 | |
| Pipetas | Eppendorf | Z683779-1EA, Z683795-1EA |
Referências
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Reimpressões e permissões
