Nós descrevemos um método reprodutível de preparação de células acinares pancreáticas de rato de um rato com a finalidade de examinar os sinais de cálcio de células acinares e lesão celular com estímulos fisiologicamente e patologicamente relevantes. Um método para a infecção adenoviral destas células também é fornecido.
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Artigo de método
Preparação de células pancreáticas acinares para Fins de cálcio Imaging, celulares Medidas ferimento e infecção adenoviral
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células acinares do pâncreas é a principal célula do parênquima do pâncreas exócrino e desempenha um papel primordial na secreção de enzimas pancreáticos no ducto pancreático. É também o local para o início da pancreatite. Aqui, nós descrevemos como células acinares são isolados a partir de sinais de cálcio intracelular tecido e pâncreas todo são medidos. Além disso, descrevem-se as técnicas de transfecção destas células com as construções adenovirais, e, subsequentemente, medindo a fuga de lactato desidrogenase, um marcador de lesão da célula, em condições que induzem a lesão das células acinares, in vitro. Estas técnicas proporcionam uma ferramenta poderosa para caracterizar acinar celular fisiologia e patologia.
Introdução
Estas alterações dinâmicas em cálcio intracelular são necessárias para os eventos de células acinares tanto fisiológicos e patológicos. Estes efeitos divergentes de cálcio são pensados para resultar de padrões espaciais e temporais distintos de cálcio de sinalização 1. Por exemplo, a enzima e a secreção de fluido a partir da célula acinar estão ligadas a pontos do cálcio a partir de uma região limitada do pólo apical onde ocorre a secreção de 2. Em contraste, uma onda de cálcio global seguida de sinais de cálcio não-oscilatórias intensas está associada com eventos patológicos iniciais que conduzem a pancreatite aguda 3,4. Estes incluem a ativação intra-acinar protease, a secreção de enzimas reduzida e lesão celular acinar. O nosso laboratório utiliza isolado ácinos pancreáticos de estudar estes eventos patológicos iniciais que conduzem a doença, tanto in vivo como in vitro 5-7. Os métodos descritos aqui descrevem o isolamento de células acinares primárias com a finalidade de medir cyníveis de cálcio tosolic e lesão celular. Um método para a infecção adenoviral destas células também é fornecido.
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Protocolo
1. Preparando células pancreáticas acinares para Imagem de cálcio
- Preparar tampão de incubação contendo HEPES a 20 mM HEPES, 95 mM de NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM MgCl 2, 1,3 mM de CaCl2, 10 mM de glucose, 2 mM de glutamina e 1 × aminoácidos não essenciais do meio mínimo de Eagle. Ajuste da solução final a pH 7,4 com NaOH.
- Preparar um tampão de incubação de BSA por adição de BSA (1% w / v final) a 25 ml de tampão de incubação de HEPES (descrito acima).
- Preparar um tampão de digestão de colagenase por adição de 1,1 mg / mL (200 unidades / ml), colagenase tipo 4 e 1 mg / ml de inibidor de tripsina de soja a 6 ml de tampão de incubação de BSA (descrito acima).
- Ácido-lavagem mm lamelas 22x22 por imersão em duas partes HNO 3 e uma parte de HCl por 2 horas. Decantar com água DI e armazenar em etanol 70%.
- Sacrificá um rato por asfixia CO 2. Orientar o animal em decúbito dorsal, e preparar a superfície abdominal por cledesmame com etanol a 70%. Realizar uma laparotomia para expor a cavidade abdominal. Dissecar o pâncreas e lave imediatamente em um pequeno barco pesar contendo 6 ml de tampão de digestão colagenase.
- Dissecar afastado qualquer grandes pedaços de vasos sanguíneos de gordura ou visível, em seguida, retire 5 ml de tampão de digestão colagenase e adicioná-lo de volta para o tubo cônico de 15 ml.
- Com uma tesoura de dissecção fina picar o pâncreas no pequeno barco pesando contendo 1 ml de tampão de digestão colagenase. Tritura até que a solução resultante aparece uniformemente dispersas.
- Transferir o produto triturado para um frasco de plástico ml de Erlenmeyer de 125, e adicionar os restantes 5 ml de tampão de digestão de colagenase para o recipiente. Certifique-se de que o tecido é completamente submerso em tampão.
- Colocar o balão num banho de água a 37 ° C e agitar a 90 rpm por 30 min. Durante este curto período de tempo de inatividade, preparar agonistas ativação de cálcio (por exemplo ceruleina, carbacol) e lavar o mm capa ácido lavado 22x22desliza com água DI. A seco, e, em seguida, colocar em cima de uma superfície plana, revestida por filme de laboratório.
- Após 30 min a digerir está completa, transferir a suspensão de volta para o tubo de 15 ml cónica e permitir que as células assentar. Pipetar cuidadosamente o tampão de digestão colagenase e substituir com 6 ml de tampão de incubação BSA. Agitar vigorosamente o tubo à mão durante 10 segundos, a fim de dispersar as células em agrupamentos mais pequenos. Imediatamente após a agitação, retirar qualquer grande, detritos flutuantes da mídia não liquidados.
- Permitir que as células restantes para resolver, e trocar os meios de comunicação com tampão de incubação fresco BSA.
- Repetir o passo 1.11, duas vezes, até a suspensão é composta por apenas pequenos aglomerados que só são finamente visível a olho nu. As células devem se assemelham aos descritos na Figura 1A (linha superior).
- Remover o tampão de incubação de BSA e HEPES substituir com tampão de incubação.
- Prepare um 750 mM, estoque 100X de Fluo-04:00 em 10% DMSO.
- Carregar as células no tubo cónico de 15 ml contendo a suspensão de células e o tampão de incubação de BSA livre de HEPES. Para fazer isso, adicionar um volume apropriado (diluição 1:100) da solução à suspensão de células. Então placa 500 ul desta suspensão em cada lamela 22x22 mm.
- Mantenha lamelas no escuro à temperatura ambiente. Dê o primeiro Ca 2 + medições 30 min após o carregamento. O corante é automaticamente removida do meio após o início da perfusão, o que deve ocorrer após 30 min de carga de corante.
2. Medição de cálcio em células pancreáticas acinares
- Lavar cada perfusão set-up com água DI e preencha com uma quantidade adequada de tampão ou agonista. Primeiro cada seringa com tampão ou agonista para garantir o fluxo adequado. Grampo seringas a um anel de ficar cerca de 1-2 metros acima do palco microscópio.
- Use uma pinça fina para agarrar com cuidado a partir de sua borda uma suspensão de células contendo lamela. Inclinar a tampaescorregar 45 °, e permitir que o excesso de tampão para fugir. Coloque a lamela sobre a vedação de borracha com as células na parte superior da lamela e montar a câmara (Figuras 2A e 2B).
- Fixar a câmara de perfusão para a fase e inserir o tubo que contém tampão para a primeira entrada da câmara (Figura 2C). Rodar a seringa contendo tampão e permitir que o tampão para perfundir sobre toda a superfície da lamela. Uma vez que o tampão tenha atingido a extremidade oposta da câmara, inserir uma linha de vácuo para a boca de aspiração. Insira quaisquer outros tubos (contendo agonistas, inibidores, etc) em sua posição apropriada ao longo da câmara.
- Visualizar as células utilizando qualquer um, 1,4 objectiva 200X ou 400X abertura numérica e de um laser de árgon para excitar o corante Fluo-04:00 comprimento de onda de 488 nm (Figura 1A, parte inferior). As configurações do laser de potência deve ser ajustada de modo que o tubo fotomultiplicador (PMT) Não está saturado com a luz emitida. Além disso, a tensão através do PMT tem de ser optimizado para a detecção de luz máxima.
- Sinais de> 515 nm de emissão de passa-longo são coletados em velocidades de quadro de 2-5 seg / frame para a visualização de padrões oscilatórios lentos e 0,2-0,3 seg / quadro para a visualização rápida, ondas de cálcio globais (Figuras 3 e 4).
- Depois de imagens estiver concluída, feche as seringas e remover toda a tubulação. Desmonte a câmara e repita os passos de 2,2-2,4.
- Coletar dados como valores numéricos de intensidade de fluorescência ao longo do tempo e transferência à Imagem J (pacote de software fornecido como freeware pelo National Institutes of Health e podem ser encontradas em http://rsb.info.nih.gov/ij/ ).
- Veja as imagens de celular em tempo real e identificar regiões de interesse (ROI, ou seja, apical, basolateral, nuclear, etc)
- Adquirir intensidades de fluorescência para estes ROIs erepresent como intensidade de fluorescência / linha de base da intensidade da fluorescência (isto é F/F0).
- Gerar traçados traçando F / F 0 vs tempo. Além de traçados de imagens representativas são geralmente fornecidas e exibida usando pseudo.
3. Preparação de células pancreáticas acinares para Ensaios lesão celular
- Quentes DMEM F-12 mídia (sem vermelho de fenol) a 37 ° C.
- Adicionar BSA (0,1% w / v final), e HCl (50 mM final) para os F-12 DMEM mídia.
- Alíquotas de 50 ml de DMEM para um tubo cónico.
- Preparar um tampão de colagenase por adição de 0,5 mg / ml (12 U / mL) de colagenase tipo IV de 10 ml de DMEM suplementado F-12 media.
- Sacrificá um rato por asfixia CO 2. Orientar o animal em decúbito dorsal, e preparar a superfície abdominal por limpeza com álcool 70%. Realizar uma laparotomia para expor a cavidade abdominal. Dissecar o pâncreas e lave imediatamente em um pequeno barco pesando containing 6 ml de tampão de colagenase.
- Picar o tecido com uma tesoura de dissecção multa para 3-5 minutos ou até que a solução resultante aparece uniformemente dispersas.
- Transferir o tecido triturada para um balão de Erlenmeyer de 125 ml com 5 ml de tampão de colagenase adicional, em seguida, colocar num banho de água em ° C 37 ° C com agitação a 90 rpm durante 5 min.
- Retire do agitador, para permitir que as células assentar brevemente, e troca com 5 ml de tampão de colagenase fresco. Em seguida incubar durante um adicional de 35 min num banho de água a 37 ° C com agitação a 90 rpm.
- Vigorosamente ressuspender a digest, utilizando uma pipeta de transferência até a suspensão se torna homogénea, sem grumos de células visíveis. Em seguida, pipeta suavemente a suspensão de células através de nylon de malha pré-molhado num erlenmeyer.
- Vigorosamente pipetar um adicional de 3 ml de DMEM fresco F-12, com meios (colagenase) através da malha, a fim de forçar através de quaisquer células restantes.
- Adicionar outro 6-10 ml de DMEM F-12 mídia e umGUARDE as células que se contentar com 2-3 min. Repetir este passo duas vezes, e remover o sobrenadante, após a última lavagem.
- Adicionar DMEM fresco F-12 media, ressuspender as células, e placa de 500 ul de suspensão celular em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 48 poços. As células devem assemelhar-se aos representados na Figura 1B.
- Permitir que a placa para se sentar em um banho de água 37 ° C a 90 rpm por 5 min antes de adicionar agonistas.
- Estimular as células com diferentes agonistas para 2-4 horas.
- Inclinação da placa em um ângulo para permitir que as células que se contentar com cuidado e pipetar uma aliquota dos meios de comunicação (normalmente 100 l) e congelamento de flash em azoto líquido.
- Flash congelar a suspensão de células remanescente. Congelamento de inflamação não é essencial para a medição de LDH. Como uma alternativa as amostras podem ser mantidas em gelo, se eles vão ser testadas no mesmo dia, ou armazenado em -20 ° C para armazenamento a longo prazo.
4. Medição de lactato desidrogenase Vazamento
- Medida de lactato desidrogenase (LDH) essencialmente o vazamento utilizando os reagentes e as instruções fornecidas no kit de ensaio Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Promega (ver Tabela de reagentes e materiais específicos).
- Reconstituir o substrato LDH (que é fornecido com o kit) com 12 ml de tampão de ensaio (também fornecidos).
- Descongelar suspensão de células congeladas e amostras de meio num banho de água à temperatura ambiente.
- Placa de 50 ul de cada amostra de material em uma placa de 96 poços.
- Para a suspensão de células, adiciona o volume necessário de 10X de tampão de lise de modo que a concentração final é de 1X. Brevemente Vortex e incubar a 37 ° C durante 60 min.
- Centrifugar as amostras lisadas a 250 xg durante 4 min a detritos sedimento celular.
- Para lisados celulares, placa 50 ul de uma diluição de 1:10 para cada poço de uma placa de 96 poços.
- Adicionar 50 ul de substrato reconstituído a cada poço, incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante 30 min.
- Parar a reacçãoadição de 50 ul da solução de paragem (fornecida com o kit) para cada poço.
- Medir a absorvância a 490 nm.
- Use a seguinte fórmula para calcular% LDH fugas. As densidades ópticas abaixo são corrigidos subtraindo uma leitura OD em branco de um poço contendo apenas PBS, substrato e solução de paragem.
LDH em media = (Media OD492) x (fator de diluição media) x (vol. de mídia) * Uma vez que não é normalmente necessário para diluir amostras de mídia, o fator de diluição na maioria das vezes equal1.
Total de LDH = ((Lysate OD 490) x (fator de diluição lysate) x (vol. em suspensão de células)) + ((Media OD 490) x (fator de diluição) x (vol. de mídia alíquota para amostragem))
5. Infectando células pancreáticas acinares com Adenovirus
- Prepararcélulas acinares pancreáticas, como descrito na seção 3.
- Seguindo o passo 3.12, adicionar 10 7 unidades infecciosas (IFUs) de adenovírus para a suspensão de células e incubar durante 30 min a 37 ° C.
- Uniformemente placa de 2 ml de suspensão de células numa placa de 6 poços.
- Para a maioria das construções de expressão, as células devem ser adequadamente infectado dentro de 18 horas, e para algumas construções luciferase, apenas dentro de 6 horas.
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Resultados
Um exemplo de medições de cálcio de células acinares, em resposta a estímulos fisiológicos é fornecido na Figura 3. As células acinares foram carregados com o corante Fluo-cálcio 4 e perfundido com a acetilcolina análogo carbacol (CCh, 1 uM)) 8. Células reagiu, sob a forma de uma onda de cálcio, que tem início na região apical e propaga à região basolateral de 3,9. Traçados representativos mostrados na Figura 3B mostram o padrão típico de pico-planalto vulgarmente ...
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Discussão
O método de isolamento de células e ensaios subseqüentes descritos aqui representam poderosas ferramentas com as quais estudam os aspectos fisiológicos e fisiopatológicos do pâncreas exócrino. O método de isolamento de células pancreáticas acinares dispersas foi descrita pela primeira vez por Amesterdão e Jamieson, em 1972, 11. Os métodos aqui apresentados foram adaptados a partir de métodos de isolamento mais recentes descritos por Van Acker e colegas 12. Embora estas técnicas são altamente reprod...
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Divulgações
Não há conflito de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por um dos Institutos Nacionais de Saúde Grant DK083327 e DK093491 (a SZH).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Camundongos | NCI | N/A | Macho 20-30 gramas; praticamente qualquer cepa deve produzir resultados comparáveis. |
| HEPES | American Bioanalytical | AB00892 | |
| Cloreto de Sódio | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Cloreto de Potássio | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Cloreto de Magnésio | Sigma | M-8266 | |
| Cloreto de Cálcio | Fischer | C79 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| L-Glutamina | Sigma | G-8540 | |
| 1X mínimo Eagle's medium mistura de aminoácidos não essenciais | Gibco | 11140-050 | |
| Hidróxido de Sódio | EM | SX0593 | |
| Albumina de Soro Bovino | Sigma | A7906 | |
| Colagenase | Worthington | 4188 | |
| Inibidor de Tripsina de Soja | Sigma | T-9003 | |
| Dióxido de Carbono | Matheson Gas | 124-38-9 | |
| 125 ml Erlenmeyer frasco de plástico | Crystalgen | 26-0005 | |
| Kit de dissecação | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| 70% Etanol | LabChem | LC222102 | |
| P1000, P100, P10 pipetas | Gilson | FA10005P | |
| Barco de pesagem | Heathrow Scientific | HS1420A | |
| Pipetas de transferência de plástico | USA Scientific | 1020-2500 | |
| Tubos cônicos de 15 ml | BD Falcon | 352095 | |
| Tubos cônicos de 50 ml BD | Falcon | 352070 | |
| Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml | Fisher | 05-408-129 | |
| Tubo de microcentrífuga de 0,65 ml | VWR | 20170-293 | |
| lamínulas de vidro de 22 x 22 mm | Fisher | 032811-9 | |
| Ácido nítrico | Fischer | A483-212 | |
| Ácido clorídrico | Fischer | A142-212 | |
| Água desionizada | N/A | N/A | |
| lamínulas de 18 x 18 mm Fischer | 021510-9 | ||
| Filme de laboratório | Parafilme | PM-996 | |
| Fluo-4AM | Invitrogen | F14201 | |
| Dimetilsulfóxido Sigma | D2650 | ||
| Luer lock | Becton Dickinson | 932777 | |
| seringa de 60 ml | BD Bioscience | DG567805 | |
| 23 ¾ agulha de calibre | BD Bioscience | 9328270 | |
| PE50 tubulação | Clay Adam | PE50-427411 | |
| Chave de fenda | N/A | N/A | |
| DMEM F-12, sem fenol vermelho | Gibco | 21041-025 | |
| Agulha de calibre 30,5 | BD Bioscience | 305106 | |
| seringa de 5 CC | BD Bioscience | 309603 | |
| Balão Erlenmeyer de 25 ml | Fischer | FB50025 | |
| Filtro de malha de nylon | Nitex | 03-150/38 Placa de cultura de | de poro de 150 |
| μm | Costar | 3548 | |
| Placa de cultura de tecidos de 96 poços | Costar | 3795 | |
| Placa de cultura de tecidos de 6 poços | Costar | 3506 | |
| Matheson | nitrogênio líquido | 7727-37-9 | |
| Kit de ensaio de citotoxicidade | Promega | G1782 | |
| Adeno-GFP | N/A | N/A | Presente de J. Williams |
| Equipamento | |||
| Anel com grampos | United Scientific | SET462 | |
| Câmara de perifusão | N/A | N/A | Projetado por S.Z.H e colegas da Universidade de Yale |
| Linha de vácuo | Manostat | 72-100-000 | |
| Banho-maria com agitador | Microscópio | 51220076 | |
| Zeiss | LSM 710 | ||
| Leitor de placas BioTek Synergy H1 | BioTek | 11-120-534 | |
| Capuz de cultura de tecidos | Nuaire | NU-425-600 | |
| Incubadora de cultura de tecidos | Thermo | 3110 |
Referências
- Toescu, E. C., Lawrie, A. M., Petersen, O. H., Gallacher, D. V. Spatial and temporal distribution of agonist-evoked cytoplasmic Ca2+ signals in exocrine acinar cells analysed by digital image microscopy. Embo J. 11, 1623-1629 (1992).
- Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. Micromolar and submicromolar Ca2+ spikes regulating distinct cellular functions in pancreatic acinar cells. Embo J. 16, 242-251 (1997).
- Husain, S. Z., et al. The ryanodine receptor mediates early zymogen activation in pancreatitis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14386-14391 (2005).
- Raraty, M., et al. Calcium-dependent enzyme activation and vacuole formation in the apical granular region of pancreatic acinar cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13126-13131 (2000).
- Orabi, A. I., et al. Dantrolene mitigates caerulein-induced pancreatitis in vivo in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299, G196-G204 (2009).
- Shah, A. U., et al. Protease Activation during in vivo Pancreatitis is Dependent upon Calcineurin Activation. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2009).
- Muili, K. A., et al. Pharmacologic and genetic inhibition of calcineurin protects against carbachol-induced pathologic zymogen activation and acinar cell injury. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).
- Orabi, A. I., et al. Ethanol enhances carbachol-induced protease activation and accelerates Ca2+ waves in isolated rat pancreatic acini. J. Biol. Chem. 286, 14090-14097 (2011).
- Nathanson, M. H., Padfield, P. J., O'Sullivan, A. J., Burgstahler, A. D., Jamieson, J. D. Mechanism of Ca2+ wave propagation in pancreatic acinar cells. J. Biol. Chem. 267, 18118-18121 (1992).
- Reed, A. M., et al. Low extracellular pH induces damage in the pancreatic acinar cell by enhancing calcium signaling. J. Biol. Chem. 286, 1919-1926 (2011).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).
- Van Acker, G. J., et al. Tumor progression locus-2 is a critical regulator of pancreatic and lung inflammation during acute pancreatitis. J. Biol. Chem. 282, 22140-22149 (2007).
- Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. Kinetic control of multiple forms of Ca(2+) spikes by inositol trisphosphate in pancreatic acinar cells. J. Cell Biol. 146, 405-413 (1999).
- Leite, M. F., Burgstahler, A. D., Nathanson, M. H. Ca2+ waves require sequential activation of inositol trisphosphate receptors and ryanodine receptors in pancreatic acini. Gastroenterology. 122, 415-427 (2002).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46, 143-151 (2008).
- Schild, D., Jung, A., Schultens, H. A. Localization of calcium entry through calcium channels in olfactory receptor neurones using a laser scanning microscope and the calcium indicator dyes Fluo-3 and Fura-Red. Cell Calcium. 15, 341-348 (1994).
- Saluja, A. K., et al. Secretagogue-induced digestive enzyme activation and cell injury in rat pancreatic acini. Am. J. Physiol. 276, 835-842 (1999).
- Husain, S. Z., et al. Ryanodine receptors contribute to bile acid-induced pathological calcium signaling and pancreatitis in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).
- Gurda, G. T., Guo, L., Lee, S. H., Molkentin, J. D., Williams, J. A. Cholecystokinin activates pancreatic calcineurin-NFAT signaling in vitro and in vivo. Mol. Biol. Cell. 19, 198-206 (2008).
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Reimpressões e permissões
