Artigo de método

Manipulação genética do rato em desenvolvimento Hipotálamo através In utero Eletroporação

DOI:

10.3791/50412

⸱

24 de julho de 2013

 ,  ,  , 
1Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Heidelberg , 2Institut de recherches cliniques de Montreal

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Apesar da importância funcional e clínico do hipotálamo, In utero Manipulação genética do seu desenvolvimento tem sido raramente tentada. Mostramos um procedimento detalhado para In utero Eletroporação no hipotálamo do rato e mostram resultados representativos (regional) transfecção hipotálamo total e parcial.

Resumo

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A modificação genética das regiões específicas do cérebro de mamíferos é o desenvolvimento de uma abordagem experimental, muito poderoso. No entanto, a geração de novos mutantes do mouse é muitas vezes frustrantemente lento. Demonstrou-se que o acesso ao cérebro do rato em desenvolvimento in utero com a sobrevivência pós-operatório é razoável possível. Ainda assim, os resultados com este procedimento foram relatados quase exclusivamente para a parte mais superficial e facilmente acessível do cérebro em desenvolvimento, ou seja, o córtex. O tálamo, uma região mais estreita e mais medial, tem se mostrado mais difícil de atingir. Transfecção em núcleos mais profundo, especialmente aqueles do hipotálamo, é talvez o resultado mais difíceis e, por conseguinte, muito poucas têm sido relatados. Aqui demonstramos um procedimento para atingir todo o neuroepithelium hipotálamo ou parte dela (regiões do hipotálamo) para transfecção por eletroporação. As chaves para a nossa abordagem é mais narcose tempos, injeção na third ventrículo, e tipo e posicionamento dos eletrodos apropriada. Além disso, mostramos resultados de segmentação e posterior análise histológica do núcleo hipotalâmico mais rebaixado, o corpo mamilar.

Introdução

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A manipulação genética do cérebro embrionário do rato é uma abordagem preferida para aprender sobre regulação do desenvolvimento. A geração de linhas mutantes de rato, porém, é lento e caro. Um método poderoso para introduzir alterações genéticas específicas no desenvolvimento de neurónios do cérebro de mamíferos está em electroporação útero. Essencialmente, a técnica consiste na transfecção de DNA para o neuroepitélio cérebro embrionário, por meio de impulsos eléctricos, em seguida, permitindo que o embrião para sobreviver durante um certo período de tempo, recolher o cérebro e examiná-las para possível nova, fenótipos informativos. Desta forma, o experimentador pode testar hipóteses quase imediatamente, sem longos períodos de espera necessários para a produção de mutantes de rato.

Transfecção de DNA em embriões em desenvolvimento começou com a eletroporação in ovo em embriões de galinha 1. A prova-de-conceito essencial para o rato foi realizado na cultura 2. Isso foi logo seguido pelas primeiras descrições da técnica no mouse no útero 3,4.

O principal problema é a transfecção do cérebro em desenvolvimento de embriões no útero, sem as matar ou a mãe. Aprender a realizar a cirurgia necessária (laparotomia, injeção, eletroporação) exige um longo período de treinamento. Uma vez que a cirurgia foi dominado até o ponto onde a taxa de sobrevivência do embrião é aceitável, a próxima pergunta chave é: quais estruturas cerebrais são acessíveis? Não surpreendentemente, os primeiros trabalhos publicados que mostram os resultados obtidos com a eletroporação utero focada no desenvolvimento cortical 5-9. O mesmo é válido para a maioria das publicações utilizando esta técnica, uma vez que a região do cérebro do rato em desenvolvimento mais acessíveis para procedimentos cirúrgicos é o córtex (Figura 1). O procedimento para a electroporação útero no córtex foi descritoem versão impressa e 10 em vídeo 11-14. Uma modificação da técnica pode ser usada para atingir uma parte ventral do telencéfalo, os gânglios da base 15.

Além do telencéfalo, diencéfalo (classicamente dividido em tálamo e hipotálamo) é uma região do cérebro anterior mais difícil de alcançar. Um pequeno número de relatórios de trabalhos de segmentação de sua parte dorsal e mais acessível, o tálamo 16-19.

O hipotálamo é a parte mais ventral do cérebro anterior, por conseguinte, a uma localizada mais profundamente da face dorsal (córtex) (Figura 1). Esta região continua a ser um desafio difícil para os pesquisadores comprometidos com a manipular geneticamente o cérebro do rato no útero. Para nosso conhecimento, só muito poucos artigos relatam os resultados de transfecção in utero no hipotálamo do rato 20,21. No entanto, a importância funcional do hipotálamo Canhãot ser exagerada, uma vez que regula comportamentos como comer e beber, acasalamento, reprodução e parentalidade 22. Além disso, alterações no desenvolvimento do hipotálamo contribuir para originar mais tarde, em condições de vida, como obesidade, hipertensão, diabetes e puberdade precoce 23. Ser capaz de alterar geneticamente o hipotálamo durante o desenvolvimento seria uma ferramenta muito poderosa para compreendê-lo.

O protocolo cirúrgico de base para a laparotomia de ratas grávidas que usamos aqui é similar ao utilizado em outros protocolos 11,13,14,24. Vamos descrevê-los aqui brevemente para ser completo. A chave para o nosso processo, por outro lado, são do tipo de anestesia, o local de injecção, do tipo de eléctrodos e a posição de inserção e o eléctrodo positivo em relação à cabeça do embrião. Nós preferimos para induzir e manter a anestesia por inalação de gás sobre anestesia intraperitoneal simples, uma vez que a primeira permite que peloum pouco mais longos períodos de narcose necessária para uma cirurgia difícil. Isoflurano resultados inalação em uma recuperação mais rápida da anestesia, já que geralmente a mãe demonstra um comportamento normal já minutos após a cirurgia. O ponto de injecção mais fácil da solução de ADN com a micropipeta de vidro é o ventrículo lateral, que, contudo, é totalmente inadequado para electroporação hipotálamo. Injeção direta no terceiro ventrículo é de fato crucial para atingir estruturas diencefálica profundas. É possível transfecção do hipotálamo ou da E12.0 E12.5 com eletrodos padrão, off-the-shelf. Encontraram-se alguns dos eléctrodos fabricados por Nepa Gene (Chiba, Japão), particularmente adequado para esta finalidade.

Com o nosso procedimento obtemos transfecção de todo o neuroepitélio hipotalâmica ou transfecção parcial, dependendo da orientação da região do eléctrodo. Aqui vamos demonstrar a técnica de transfecção do corpo mamilar, sem dúvida,o mais profundo e recesso de todos os núcleos do hipotálamo. Além disso, mostramos análise histológica detalhada das células transfectadas até ao nível celular de resolução.

Uma comparação de electroporação no útero com outras abordagens para transfecção do cérebro do rato em desenvolvimento in utero pode ser encontrado na secção Discussão.

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Protocolo

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1. Preparação de DNA e vidro Micropipetas para Injeção

  1. Bons micropipetas de vidro de qualidade é essencial para reduzir a taxa de abortos inicial elevado, devido à perda de líquido amniótico. O procedimento para puxar micropipetas de vidro tem sido bem documentada 13,18,25. Use 1,2 milímetros de diâmetro capilares puxado em um dispositivo convencional Sutter P-97 com as configurações de P = 500; Calor = 300; Puxe = 40; Velocity = 50; Time = 50. Monte o extrator com três milímetros filamentos "vale" (Sutter Instrument FT330B). Os filamentos de dois milímetros de tamanho produziram para nós, resultados menos satisfatórios. Por outro lado, o bisel da micropipeta dicas não parece melhorar os resultados para nós.
  2. Dissolver purificada, isenta de endotoxinas DNA de plasmídeo em PBS (Grau cultura celular) contendo 0,1% de verde rápido para uma concentração final de 1 a 2 mg / mL. O verde rápido tornará visível a solução injectada no ventrículo do cérebro embrionário.
  3. Carregar 10 ml de solução de ADN para a micropipeta de vidro.
  4. Ligue a micropipeta de vidro para o sistema de injeção (bomba Pico) ou pipeta de boca.

2. Anestesia

Preparar a mesa cirúrgica com uma almofada de aquecimento e os instrumentos cirúrgicos. Ligar as fontes de luz fria para facilitar a visualização dos embriões. Desinfetar os instrumentos cirúrgicos, utilizando, por exemplo, um talão esterilizador de vidro.

Três procedimentos de anestesia diferentes são possíveis para este protocolo (ver Discussão). Aqui descrevemos a que consideramos o melhor, usando inalação de isoflurano para a indução da anestesia (taxa de fluxo de 0,5 L / min), bem como a manutenção (caudal de 1 L / min).

  1. Introduzir o mouse grávida em uma pequena transparente (para que o rato permanece visível) recipiente ligado ao Marcos 5 anestésico dispositivo Komesaroff por um curto período de tubulação.
  2. Encher o vaporizador com isoflurano, em seguida, abrir o frasco de oxigénio ligado ao dispositivo. Soprar um ou dois pulsos de isoflurane / oxigênio (0,5 L / min) para o recipiente com o mouse e relógio para narcose para definir pol
  3. Leve o mouse para fora, cubra seus olhos com pomada para impedi-los de secagem e ajustar a máscara de anestesia o fluxo em sua cabeça imediatamente.

3. Laparotomia

  1. Posicione o mouse de barriga para cima sobre a almofada de aquecimento (caso contrário, a temperatura do corpo vai descer muito rápido, diminuindo as chances de recuperação) e garantir o seu corpo no lugar, fixando suas quatro pernas para os lados com fita adesiva. Avaliar a profundidade da anestesia através da verificação de perda de resposta à estimulação de reflexo (por exemplo, do dedo do pé ou de aperto da cauda, ​​com uma pressão firme).
  2. Raspar a superfície abdominal e desinfectá-la com o iodophorpovidone-iodo (Braunoderm).
  3. Adicione uma incisão longitudinal (1 a 1,5 cm de comprimento) sobre a pele abdominal. Em seguida, corte o peritônio. Coloque gaze de algodão ao redor da incisão. Faça um corno uterino visível e puxe-o cuidadosamente com uma pinça sem corte para o PBS-lavadas gauze. Lavar o útero com PBS muito frequentemente para mantê-lo sempre humedecido (Figuras 2A e 2B). Durante todo o procedimento evitar puxar o mesométrio ou do útero apertado, uma vez que a alta pressão no interior do útero irá transmitir ao embrião aumentando as chances de perda de líquido sobre injeção, resultando em aborto.

4. Injecção de DNA para o ventrículo cerebral

  1. Segurar o útero de tal forma que os ventrículos cerebrais podem ser visualizados. Não extensivamente reposicionar um embrião que se encontra em uma posição desfavorável - isso só aumenta as chances de aborto.
  2. Olhando para a cabeça do embrião a partir de cima, localizar visualmente o espaço ou fissura entre os hemisférios esquerdo e direito do córtex. Os hemisférios são fáceis de distinguir e os ventrículos laterais dentro deles (a não ser alvo) pode geralmente ser entendido como formas ligeiramente mais escuras. Se um embrião é encontrado para ser perfeitamente orientada para a injeção de DNA (Figures 2C e 2D), é possível perfurar a parede uterina e se introduzir o terceiro ventrículo de uma vez. Segurar a micropipeta de vidro a 45 ° em relação à parede do útero e punção no final rostral do fosso entre os hemisférios corticais, penetrando para cerca de 1 mm. Deste modo, a ponta da micropipeta de vidro vai entrar no terceiro ventrículo do cérebro (não no ventrículo lateral) (Figuras 2C e 2D). Em embriões menos favorável orientadas é útil para perfurar a primeira parede uterina (sempre a 45 °), na vizinhança da cabeça embrionária, colocar a ponta da micropipeta na posição correcta entre os hemisférios corticais e só depois perfurar o cérebro. Injectar cerca de 1 ul de solução de ADN para o terceiro ventrículo (uma boa injecção enche com fluido no ventrículo verde). Repita o mesmo procedimento com todos os embriões de um chifre útero. Isso permite algum tempo para a solução de ADN para misturar uniformemente com o fluido atingir o ventricular e entire neuroepithelium.

5. Segmentação do hipotálamo para Eletroporação

  1. Desligue o electroporator e ajustar as configurações de acordo com a idade embrionária (para E12.5 usamos 5 pulsos de onda quadrada, 50 V, 50 ms ON/950 ms OFF). Use como pólo positivo do eletrodo de agulha de aço inoxidável (CUY550-10) e como pólo negativo de um eletrodo liso rodada (CUY700P4L). (É importante que os eléctrodos são menores do que o embrião, pois caso contrário, a corrente flui através do embrião, mas não por ele.)
  2. Selecione para eletroporação os embriões cujo lado dorsal é para cima (ou seja, voltada para o experimentador) (como a maioria deles são), e descartar aqueles cuja orientação não é favorável. Agora é seguro para tocar o útero com os dedos etanol desinfetadas ou com luvas. Segurar o útero com uma pinça, no entanto, iriam interferir com o fluxo de corrente durante a electroporação.
  3. Perfuram a parede uterina por cabeça do embrião entre a amnsac iotic ea placenta empurrando para baixo com ele através da ponta do eléctrodo de agulha. Use o dedo indicador da outra mão, como bloco de empuxo. Cerca de 5 mm da ponta do eléctrodo deve ser agora entre o saco amniótico e a parede uterina, a cerca do nível do mesencéfalo (figuras 2E e 2F). Lembre-se que este é o "alvo eletrodo", pelo que a sua posição vai determinar qual parte do neuroepithelium hipotálamo é o mais provável de ser transfectadas. O embrião tem que ter muito cuidado "espremido" entre os eletrodos.
  4. Com a outra mão, a posição do eléctrodo plano rodada do lado de fora da parede do útero, no lado oposto da cabeça do embrião (Figuras 2E e 2G).
  5. Utilize o pedal para aplicar tensão (50 V, 50 ms ON, 950 ms OFF, 5 pulsos de onda quadrada).
  6. Puxe lentamente o eletrodo de agulha para fora do útero, mantendo o útero de volta com o dedo indicador da outra mão - se amniocentesetic líquido é perdida através da parede perfurada, usualmente o embrião vai sofrer aborto. Repita o procedimento com todos os embriões.
  7. Voltar trompa do útero no abdômen e repetir a injeção e eletroporação no corno restante.

6. Finalizando a cirurgia

  1. Após a injeção e eletroporação de todos os embriões, coloque o útero de volta ao abdômen com muito cuidado, posicionado exatamente como eram antes e úmido da cavidade peritoneal com solução salina antes de fechá-la.
  2. Sutura do peritônio com Categutes (Vicryl poliglactina 910, 5-0, Ethicon V4914). Para o encerramento do uso de pele ", interrompeu ponto" methodwith uma sutura mais resistente (Supramid Nylon, 6-0, Serag Wiessner TO 07171L).
  3. Desinfectar a superfície abdominal com iodo-povidona (Braunoderm) e injectar um não-esteróide anti-inflamatório, por via subcutânea (por exemplo, 100 ul de uma solução a 1:10 de Rimadyl em 0,9% de NaCl), ou, ainda melhor, um opiáceo como buprenorphine (Temgesic, 0,05 a 0,1 mg / kg de peso corporal em 0,9% de NaCl), para aliviar a dor.
  4. Remover a mãe do aparelho de anestesia e colocá-lo em uma gaiola, que é aquecida por uma almofada de aquecimento. Monitorizar o rato continuamente até que esteja completamente recuperado da anestesia. Mais tarde, verifique os animais diariamente para garantir que eles estão se recuperando do procedimento, sem qualquer sinal de infecção ou dor.

7. Analisando os resultados

  1. Colher os embriões (ou postnatals) de acordo com o dia da análise desejada. Ratos pós-natais (1 a 2 dias de idade) são sacrificados por decapitação.
  2. Separar cada embrião de acordo com a anotação electroporação anterior. Dissecar o cérebro sob um estereomicroscópio e vá ao microscópio para o sinal fluorescente verde (GFP a partir do repórter) na região adequada.
  3. O cérebro seleccionado pode ser analisada "fresco": fixar o tecido durante um curto período de tempo, em 4% de paraformaldeído e incorporar em agarose a 4% e em microesferas de gelatina a umlbumin, em seguida, a secção de um dispositivo do tipo vibratome (Figura 3). Para uma análise mais pormenorizada imunohistoquímica (Figura 4), ​​crio-protegem o cérebro em solução de sacarose a 30%, em outubro incorporar o meio de montagem (Tissue Tek) depois cortar secções 20 mM num criostato.

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Resultados

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A maioria dos neurônios do hipotálamo nascem entre E11.5 a E15.2, de acordo com análise de nascimento-dating no rato 26 traduzido para o desenvolvimento um pouco mais curto do rato 27,28. O pico de neurogênese hipotálamo é atingido a E12.5 29-31. Por conseguinte, com a idade de transfecção escolhido para o presente estudo (E12.5), uma grande proporção dos neurónios hipotalâmicos podem ser marcados em qualquer nível rostro-caudal.

Análise em E18.5 em secções e...

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Discussão

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Sobre a anestesia: Como no útero electroporação no hipotálamo pode ser tecnicamente difícil e narcose requerem tempos mais longos, preferimos para induzir e manter a anestesia por meio da administração de uma mistura de oxigénio e isoflurano. Na nossa experiência, os animais podem permanecer convenientemente anestesiados deste modo por períodos de até, pelo menos, uma hora, a recuperação da mãe é muito rápido, e melhorou a sobrevivência dos embriões. Outras abordagens para a anestesia, também estão disponíveis....

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (Deutsche Forschungsgemeinschaft).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
 REAGENTS
AcepromazineSanofi GmbHanestésico
IsofluranoBaxterHDG9623anestésico
KetaminPharma GmbH
Fast GreenFluka44715 
RimadylPfizeranti-inflamatório não esteróide
Braunoderm Braun3887138povidona-iodo
Fosfato Tampão Salino PBSGibco14190 
Temgesic (buprenorfina)Essex Pharmaopioid analgésico
para os olhos PomadaPan-Ophtal7136926 
XilazinaBayer 
 EQUIPAMENTO
Dispositivo Anestésico Komesaroff Mark-5Medical Developments AustraliaACN 004 903 682 
Extrator capilar P-97Sutter Instrument Co.P-97 
CompresstomePrecisionary Instr.Dispositivo de vibratomoVF-300
Microscópio ConfocalZeissLSM700 
CriostatoLeicaCM3050S 
EletroporadorNepa Gene Co. Ltd.CUY21EDIT 
Eletrodo 1Nepa Gene Co., Ltd.CUY550-10Eletrodo de Agulha de Aço Inoxidável, 10 mm-Ponta, 0. 5 mm de diâmetro.
Eletrodo 2Nepa Gene Co. Ltd.CUY700P4LTampa Redonda Placa de Platina 4 mm de diâmetro
Fonte de luz fria de fibra ópticaLeicaKL2500 LCD 
Capilares de vidroHarvard ApparatusGC120T-151. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D.
Esterilizador de esferas de vidroFerramentas de Ciência FinaFST250 
Almofada de aquecimentoAparelho Harvardpy872-5272 
Dispositivo de injeçãoPico da World Precision InstrumentsPV820 
Sutura Revestida com Fio VicrylEthiconV4914Sutura Peritoneal
Sutura Thr. SupramidSerag WiessnerTO07171LSutura da Pele
Bomba Pneumática

Referências

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