Artigo de método

Micromanipulação de expressão gênica no cérebro adulto Zebrafish Usando microinjeção Cerebroventricular de Morpholino Oligonucleotides

DOI:

10.3791/50415

⸱

23 de maio de 2013

 ,  ,  , 
1DFG-Center for Regenerative Therapies Dresden, Cluster of Excellence (CRTD) and Biotechnology Center (BIOTEC) of the Technische Universität Dresden

Neste artigo

Resumo

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Neste artigo, é demonstrar um método para a manipulação da expressão de genes nas células dos ventrículos do telencéfalo peixe-zebra adultos utilizando oligonucleótidos anti-sentido morfolino. Apresenta-se este método como um protocolo eficiente e rápida, que pode ser utilizado para estudos funcionais no cérebro adulto vertebrado.

Resumo

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A manipulação da expressão de genes nos tecidos é necessária a realização de estudos funcionais. Neste trabalho, nós demonstramos a técnica de microinjecção (IMV) cerebroventricular como um meio de modular a expressão do gene do peixe-zebra, no cérebro adulto. Usando IMV, as substâncias podem ser administradas para o fluido cerebroventricular e ser completamente distribuído ao longo do eixo rostro-caudal do cérebro. Nós especial atenção para a utilização de oligonucleótidos anti-sentido morfolino, os quais são ferramentas potentes para derrubar a expressão do gene in vivo. Neste método, quando aplicado, morfolino moléculas são absorvidas pelas células que revestem a superfície do ventrículo. Essas células incluem as células gliais radiais, que atuam como progenitores neurogênica. Portanto, derrubando a expressão do gene nas células gliais radiais é de extrema importância para analisar a resposta neurogênese generalizada no peixe-zebra, e também proporcionar insights sobre como os vertebrados poderia sustentar neurogen adultoesis resposta. Tal entendimento também ajudaria os esforços para aplicações clínicas em doenças neurodegenerativas humanas e regeneração do sistema nervoso central. Assim, apresentamos o método de microinjeção cerebroventricular como uma maneira rápida e eficiente para alterar a expressão genética e resposta a neurogênese no cérebro anterior zebrafish adulto. Também fornecem dicas para solução de problemas e outras informações úteis sobre como realizar o procedimento IMV.

Introdução

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Neurogênese adulta é uma característica comum aos vertebrados, no entanto o seu grau de prevalência e eficiência varia de acordo com a filogenia 1,2,3,4,5,6. Por exemplo, os cérebros de mamíferos adultos contém regiões de células-tronco em grande parte restritas a parte frontal do cérebro 7,8, enquanto o peixe-zebra teleost contém dezesseis domínios de células-tronco diferentes e zonas neurogênicas associados em todo o seu cérebro 4,5,9,10. Esta variação entre mamíferos e peixes-zebra pode refletir uma disparidade nos mecanismos de manutenção de células-tronco ea capacidade neurogênica de células progenitoras. A competência ao longo da vida do peixe-zebra para a produção de neurônios no cérebro também pode representar implicações clínicas como os mecanismos moleculares empregados por zebrafish cérebro poderia ser aproveitada para aplicações terapêuticas para combater as doenças neurodegenerativas em humanos.

Várias células estaminais zonas do cérebro de peixe zebra adultos foram analisados ​​e foi demonstrado que océlulas que revestem a superfície ventricular dessas regiões servem como células progenitoras 9,11-20. Análises detalhadas no telencéfalo peixe-zebra, por exemplo, identificou as células gliais radiais, os quais delimitam a superfície do ventrículo desta região do cérebro a ser progenitores neurogénicos 19, 20. Isso vale para outras regiões, como o cerebelo eo tecto óptico, onde ventricularly localizado células gliais fornecem a entrada neurogênica 16,21. Para este fim, a compreensão dos mecanismos moleculares que regulam a competência neurogénica generalizada no cérebro de peixe-zebra adulto requer manipulação da expressão de genes nas células progenitoras.

Vários métodos foram descritos anteriormente para a modulação da função do gene do peixe-zebra. Estes incluem a geração de linhas de transgénicos condicionais que expressam variantes desejadas de uma única proteína, injecções focais baseados plasmídeo acoplados a electroporação ou tratamentos químicos. Nós já projetou umMétodo para a administração de várias substâncias, incluindo oligonucleótidos morfolino ou proteínas do peixe-zebra para o cérebro adulto utilizando microinjecção cerebroventricular como uma maneira rápida e eficiente de modular a função do gene nas células ventriculares do adulto zebrafish prosencéfalo 22. Nos nossos estudos, in vivo morpholinos foram utilizados devido à sua química que envolve a molécula morfolino ligado covalentemente a arginina péptidos ricos de entrega, o que permite o fornecimento eficaz às células de interesse e sem necessidade de permeabilização extra, tal como electroporação 23. Isso permitiria que a segmentação completa do tecido desejado após a injeção, assim como o que foi observado em adulto zebrafish telencéfalo 22. Utilização de morpholinos in vivo são, portanto, superior à dos métodos já existentes, tais como o tecido alvo electroporação ou injecção focal de moléculas de ADN.

Aqui, vamos demonstrar visualmente como podemos realizar esta operação e proporcionar umaprotocolo de passo-a-passo. Começamos com a explicação preparação da mistura de injecção e os peixes a ser injetado, e continuar demonstrando como o aparelho de injeção é configurada. Nós proporcionamos uma descrição do método de injecção cerebroventricular, que envolve a geração de uma incisão no crânio e injecção das morpholinos utilizando microinjetor. Também elaborar sobre os pontos críticos é preciso ser cauteloso durante todo o processo, declarando-os como otimização ou guias de solução de problemas.

Protocolo

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1. Preparação da mistura de injecção

  1. Use morpholinos vivo como células internalizá-los de forma mais eficiente do que as moléculas morfolino normais. Veja informações do fabricante para obter mais informações (Tabela 1: Reagentes e Materiais).
  2. É um corante de rastreio fluorescente (por exemplo, vermelho CellTracker CMTPX, Invitrogen) para visualizar a exactidão da injecção. Este corante é metabolizado na célula e se torna fluorescente apenas na célula após a ingestão. Portanto, este passo é crucial para determinar que as células que são orientadas de forma eficiente pela cerebroventricular microinjecção.
  3. Preparar tampão fosfato salino (PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM de KH 2 PO 4, pH: 7,4) para diluir solução morfolino. Se for necessária uma diluição da solução de morfolino, usar sempre PBS.
  4. Prepare a 10 ul da mistura através da adição de injecção 9 ul da solução de morfolina e 1 ml de thcorante rastreador celular e (diluído ou diluído A concentração estoque da solução morpholino é 500 mm Nossos resultados anteriores 22 indicam que várias doses diferentes do morpholino -.. que variam de 50 mm a 500 mm - resultam em diferentes níveis de knockdown de um eficiente knockdown para fenótipos hypomorphic). 1 ml de solução é suficiente para injeção em um cérebro de zebrafish.
  5. Misture bem e guarde em temperatura ambiente até que a injeção.

2. Preparação do aparelho de injecção

  1. Preparar a injeção de capilares de vidro usando um extrator de agulha. Utilize os seguintes parâmetros: o valor do ciclo de aquecimento: 463, puxando valor de ciclo: 230, velocidade: 1,5 seg, tempo: 75 ms.
  2. Ligue a fonte de pressão e ajustar as configurações de pressão para 50 psi ou 3,5 bares.
  3. Ajuste as configurações microinjetor da seguinte forma: manter a pressão de 20 psi, pressão de ejeção de 10 psi, o valor de 2,5 e 100 ms gama de gating período.
  4. Transformaro iluminador anel e localizar o anel sobre a platina do microscópio.
  5. Colocar o suporte capilar para uma posição adequada para o próximo microscópio.
  6. Inserir o capilar de vidro para o suporte. Ajustar o ângulo de injecção de 45 graus.
  7. Encaixe a ponta do capilar de vidro usando uma pinça de ponta fina e calibrar a pressão de saída do orifício. Isto deve ser testado pela imersão da ponta da agulha para dentro da água de peixe e dando um pulso de pressão constante. As bolhas de ar resultantes deve ser apenas uma linha, que é uma indicação da pressão óptima / tamanho do orifício. Por favor, veja o vídeo de demonstração deste calibração.
  8. Carregue o capilar de vidro com a solução de injeção sem bolhas de interceptação.
  9. Aplicar pressão para remover o ar entre a ponta do capilar de vidro e a solução injectável carregado.

3. Anestesia

  1. Preparar a solução estoque dos anestésicos (0,1% MESAB - etil-m-aminobenzoato metanossulfonato).
  2. Remover o número desejado de peixe de seus tanques em gaiolas de rato de plástico ou outro recipiente de transporte, com quantidade suficiente de água.
  3. Preparar a solução de anestesia em uma pequena caixa de plástico através da mistura de 200 mL de água de peixe, com 5 ml de solução de estoque de anestésicos. A concentração final do anestésicos: 0,0025% (v / v).
  4. Half-encher um prato de plástico Petri com anestésicos. Utilize este prato para injectáveis.
  5. Incubar a pescar nos anestésicos até que o subjuga peixe.

4. Incisão e microinjeção Cerebroventricular

  1. Retire o peixe da caixa usando uma rede de pesca e colocá-lo na placa de Petri.
  2. Gentilmente segurar o peixe com o forceps e orientar a cabeça de uma maneira que ela se inclina ligeiramente para baixo. Isto irá facilitar a incisão.
  3. Gerar uma pequena fenda no crânio, utilizando uma agulha farpado-end de calibre 30. É apenas a ponta da agulha e não penetram mais do quesuficiente para o cérebro, pois isso irá causar danos ao tecido cerebral e irá manifestar como sangramento.
  4. Mantenha o peixe e inserir a ponta do capilar de vidro através do local da incisão.
  5. Orientar a ponta do capilar de vidro para o telencéfalo. Evitar tocar no tecido do cérebro, pois isso produz danos no tecido e também evita que a dispersão da solução injectada.
  6. Injectar a solução. O líquido dispersa imediatamente após a injecção.

5. Recuperação e análise da injeção de Precisão

  1. Retire o peixe a partir da configuração de injeção e colocar em uma caixa de plástico com peixes de água doce.
  2. Permitir a recuperação.
  3. Re-anestesiar o peixe com 0,0025% MESAB brevemente e deixe o peixe sob o microscópio de fluorescência. A dispersão completa da fluorescência vermelha é uma indicação de distribuição generalizada do líquido injectado.
  4. Coloque o peixe de volta para a caixa de plástico.
  5. Ligue a caixa de plástico para tele sistema de circulação para oxigenar o peixe e manter durante longos períodos de tempo.
  6. Usar o peixe para fins desejados, tais como análises de comportamento ou sacrificar os animais a pontos de tempo desejado após a injecção para preparar as amostras de tecido para as análises histológicas (colorações imuno-histoquímica, etc.) As referências a seguir dão exemplos de como analisar o cérebro do peixe-zebra adulto: 9,11,17-20,24-27. O tempo mais rápido para observar um knockdown eficiente (mais de 50% knockdown) foi de 12 h nos nossos estudos, 22.

6. Controles científicos sugeridos

  1. É uma molécula morfolino incompatibilidade que não é suposto causar qualquer fenótipo como um controlo negativo. Use uma molécula morpholino padrão ou especificamente do projeto de controles morfolino para cada gene de interesse. Além disso, utilize-se o solvente (neste caso, PBS) como mais um controlo negativo para avaliar os efeitos de toxicidade ou não-específicas do mismovadia / controlar morfolino injeções.
  2. Use PCNA morpholinos descrito anteriormente 22 como controlos positivos. Isto faz com que morfolino knockdown eficiente no cérebro do peixe-zebra adultos (75-95% de eficiência knockdown dentro de 1 dia após a injecção) 22.

Resultados

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Microinjeção Cerebroventricular leva a ampla distribuição da solução injetada

Usando o regime de fluxo de trabalho e técnica da microinjecção cerebroventricular representado na Figura 1, administrou-morfolino oligonucleótidos no cérebro adulto peixe-zebra. Um protocolo de injecção exacta leva à dispersão do líquido injectado em todo o cérebro e eficiente segmentação das células perto da superfície do ventrículo esquerdo (Figura 2A). Injecções onde o capilar de vidro, espeta o tecido cerebral terá um sinal fluorescente denso no ponto de injecção (Figura 2B). Se a quantidade injectada não é suficiente, o sinal fluorescente fraco será observado (Figura 2C).

Microinjecção Cerebroventricular pode ser usado para derrubar a expressão do gene na região do ventrículo do cérebro de peixe zebra adultos

Nós mostramos ªNa Vivo morpholinos podem penetrar algumas células no interior de diâmetros superfície ventricular e, portanto, podem ser eficazes para atingir as células ventriculares (Figuras 3A, 3B). Morfolino injecção pode expressão do gene knockdown uma vez que irá aliviar a produção da proteína correspondente (um exemplo é o PCNA como mostrado nas figuras 3C, 3D). Nós demonstramos anteriormente que derrubar genes usando esta técnica leva a consequências funcionais durante a neurogênese adulta (Figuras 3E, 3F) ou resposta regeneração (Figuras 3G, 3H). Demonstrou-se que o intervalo de knockdown eficiente (mais de 50% knockdown) é alcançada cerca de 12 horas após a injecção do morpholinos 22. Observamos também que período knockdown eficiente é até aproximadamente 5 dias após a injeção da proteína PCNA 22. Mais de 70% knockdown foi visto até 3 dias após a injecção 22. As curvas knockdown são o dependenten o nível de expressão das proteínas endógenas e da eficiência das moléculas de morfolino, e tem que ser determinada para cada gene pelo experimentador. Em nossos estudos, nós não vimos que o procedimento IMV compromete a sobrevivência do animal, provavelmente porque a administração das moléculas morfolino é local e não causar uma toxicidade sistêmica.

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Figura 1. Representação esquemática da técnica de injecção cerebroventricular. (A) A injecção é realizada a partir da dorsal do peixe-zebra adultos (1) ao nível do tecto óptico (ot, 2). É feita uma incisão ao longo da placa do crânio tectal óptica com uma agulha de calibre 30 (3). Usando capilares de vidro, as moléculas morfolino são injectados no fluido do ventrículo esquerdo (4). Uma dispersão completa é umachieved instantaneamente (5). (B) A cânula e sua farpado final é mostrado em grande ampliação. (C) A orientação da agulha antes da incisão. (D) A incisão é circulado e delineada por linhas tracejadas. (E) A injecção capilar fica imediata e injecção é executada. Todos os painéis foram adaptados de ref. 22. Clique aqui para ver a figura maior .

figure-results-2
Figura 2. A comparação da eficiência de injecção e precisão. (A) Um bom injecção leva a segmentação das células perto da superfície do ventrículo. (B) se o capilar de vidro é introduzido no tecido do cérebro, este irá gerar um sinal de fluorescência localizada centralmente. (C ) Se a quantidade de injeção é baixo, isso vai levar a sinal de fluorescência mais fraca.

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Figura 3. . Penetração Morpholino, a eficiência de knockdowns genes e as conseqüências funcionais (A) GFP imunomarcação nas seções transversais telencefálicos de controle morpholino-injetados Tg (H2A: GFP) linhagem transgênica mostrando núcleos GFP-positivo. (B) GFP imunomarcação nas seções transversais telencefálicos da GFP antisense morpholino-injetado Tg (H2A: GFP) linhagem transgênica mostrando núcleos GFP-positivo. Note-se a diferença no sinal de GFP na região ventricular. v: ventrículo. (C) imunomarcação para PCNA controle morpholino-injetado cérebro que mostram a distribuição generalizada de células PCNA-positivos. ( D) PCNA imunocoloração em PCNA antisense cérebros morpholino injetados mostram valores significativamente reduzidos de células PCNA-positivas, mostrando que IMV can knockdown genes endógenos. (E) BrdU e HuC / D imunomarcação no controle morpholino-injetado cérebro para determinar neurônios recém-nascidos depois de um experimento de pulso-chase BrdU descrito anteriormente 22. (F) BrdU e HuC / D imunocoloração em PCNA antisense cérebros morpholino-injetados para determinar neurônios recém-nascidos depois de um experimento de pulso-chase BrdU descrito anteriormente 22. (L) para baixo Knocking PCNA leva a uma redução significativa na geração de neurónios-nascidos, indicando que o IMV pode ser utilizado para os genes endógenos de knockdown, que dão origem a consequências funcionais. Todos os painéis foram adaptados de ref. 22 Clique aqui para ver a figura maior .

Discussão

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O método descrito aqui permite a administração fácil e rápida de morpholinos no cérebro do peixe-zebra adulto. Nós demonstramos que o nosso método de injecção bloqueia eficientemente a expressão do gene nas células dos ventrículos e resulta em consequências funcionais na resposta neurogenesis.

Há pontos importantes a serem cautelosos sobre durante a execução da microinjeção cerebroventricular. Por exemplo, o efeito das moléculas morfolino depende da concentração utilizada. Esta concentração deve ser determinada pelo utilizador final. Recomendamos começar com a solução estoque (500 mm) e realizar diluições seriadas e, idealmente, de pré-teste por injeção em embriões utilizando protocolos padrão embrião injeção 28-30. Anteriormente, foram obtidos diferentes níveis de eficiência de knockdown com concentrações de morpholinos que variam de 50 pM a 500 pM 22. Em segundo lugar, o orifício do capilar de vidro não deve ser large como isso vai levar a grande afluxo de líquido dentro do cérebro após a injecção. Da mesma forma, a abertura não deverá ser muito estreita como isso vai impedir de injecção adequada. Pode-se determinar a melhor combinação de orifício de pressão por bombeamento de ar numa placa de Petri com água. As bolhas resultantes devem estar em uma única linha, mas não em linhas múltiplas. Demonstramos este no vídeo. Em terceiro lugar, a incubação do peixe nos anestésicos é crítica. O peixe não deve ser mantido por mais tempo do que 2 minutos nos anestésicos. Isso vai dificultar a taxa de recuperação após a injeção. Em quarto lugar, o local da incisão é crítica para dispersar completamente o líquido injectado. A região ventricular ao longo do tecto óptico é maior acima da linha média e fica mais estreito lateralmente. Portanto, o experimentador deve gerar a ranhura no crânio, perto da linha média e apenas caudal ao crânio placa que cobre a região telencefálica.

Uma das vantagens do injectio cerebroventricularMétodo N (IMV) é a sua rapidez. IMV é um método rápido para ensaio da função dos genes. Esta característica é importante e útil, quando comparado com a geração de linhas transgénicas para estudos funcionais, que geralmente levam vários meses. Além disso, IMV leva a uma distribuição uniforme do líquido injectado e, por conseguinte, fornece uma manipulação relativamente minuciosa da actividade do gene, quando comparado com injecções focais ou electroporação. Com IMV, vários genes podem ser derrubados simultaneamente por que prepara a injeção mistura contendo morpholinos múltipla oligonucleotídeo. IMV pode ser utilizada para injectar diferentes concentrações de uma dada oligonucleótidos morfolino, e, portanto, pode ser usado para analisar os fenótipos hypomorphic. Finalmente, este paradigma de injecção não provoca toxicidade ou comprometer a sobrevivência dos animais.

A técnica IMV pode ser expandida para outros tipos de estudos, como a injeção de peptídeos moduladores, drogas, plasmídeo de DNA ou RNA modulatory molecules ou outras substâncias que possam afetar a fisiologia das células. Assaying combinação de moléculas e realizando análises de dose-resposta são possíveis utilizando o nosso método, o que permite estudar fenótipos hypomorphic. Com essas propriedades, IMV revela-se um ensaio rápido e fácil para os estudos de expressão no cérebro adulto peixe-zebra, e abre-se triagem rápida e análises funcionais.

O cérebro do peixe-zebra adulto pode constitutivamente produzir novos neurônios ao longo de todo o eixo rostrocaudal e também pode regenerar após lesões traumáticas. Isto está em contraste gritante com cérebros de mamíferos com a neurogênese limitado e se em tudo, bastante pobre capacidade regenerativa. Essa atividade de células-tronco generalizada e capacidade de recuperação faz paulistinha um organismo modelo útil para a compreensão dos programas moleculares necessários para a regeneração do sistema nervoso central, que estão atualmente em grande parte desconhecido. Portanto, a investigação da base molecular da capacidade regenerativa do zebrafish cérebro é um campo de pesquisa que pode explicar a diferença fundamental como peixes e mamíferos cérebro reagir após uma lesão, e também dotar caminhos para terapias médicas regenerativas em seres humanos. Para entender a infra-estrutura molecular de vertebrados plasticidade cerebral e na regeneração, as células gliais servir como uma área de pesquisa importante, pois são os progenitores neurogênicas 3,8,20. Assim, utilizando a técnica de IMV para alterar a função de genes nas células da glia radial do cérebro zebrafish é fundamental para elucidar como o cérebro de peixe pode acoplar atividade progenitor a neurogênese adulta eficiente e resposta regenerativa. Mostrámos recentemente o envolvimento e exigência de vários factores e caminhos de sinalização em resposta a neurogénese regenerativa do peixe-zebra cérebro adulto 24,26,27, e estes estudos foi tornada possível pela utilização do método de IMV. No geral, o conhecimento que adquirimos a partir de zebrafish cérebro poderia ser aproveitada para impor regenecapacidade operatória para as células gliais mamíferos que reagem aos ferimentos e, portanto, ajudar a projetar terapias clínicas para distúrbios neurológicos humanos e lesões agudas.

Divulgações

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Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 655) e da União Europeia (ZF-Saúde).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagent/Material
CellTracker Red CMTPXLife Technologies, InvitrogenC34552Use na diluição de 1:100 para medir a precisão da injeção
MESAB (metanossulfonato de etil-m-aminobenzoato)Sigma-AldrichA5040Para anestesiar as
placas de Petride peixe Sarstedt821.472Para manusear o peixe durante a injeção e imagem
Phosphate-bufferedsalina Life Technologies, GIBCO10010-056Como meio de diluição estéril
Vivo morpholinosGene Tools Inc.Personalizado Mais informações sobre morfolinos vivo: www.gene-tools.com
Equipment
Barbed-end needleBecton-Dickinson305178Para gerar a incisão no crânio
Microscópio de dissecaçãoOlympus, Leica, ZeissVaria de acordo com o fabricanteParte de toda a configuração de injeção
Dumont PinçasWorld PrecisionInstruments 501985Para tirar a ponta do capilar de vidro
Câmera de fluorescênciaZeiss, Nikon, LeicaVaria de acordo com o fabricantePara visualizar a fluorescência após a injeção
Gillies Dissecting FórcepsWorld Precision Instruments501265Para manter o peixe na posição
Injeção de vidro capilaresWorld Precision InstrumentsTWF10Para microinjeção
Kit PicoNozzle (suporte do microinjetor)World Precision Instruments5430-12Para microinjeção
Pneumática PicoPump (microinjetor)World Precision InstrumentsSYS-PV820Para microinjeção
Iluminador de anel; Guia de luz de anelParkland ScientificILL-RLGPara iluminar a amostra

Referências

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