Reconstituição de um canal de Kv para membranas lipídicas de Estudos estruturais e funcionais

Resumo

Procedimentos para a reconstituição completa da voltagem dependentes do canal de potássio protótipo em membranas lipídicas são descritos. Os canais reconstituídos são adequados para ensaios bioquímicos, gravações elétricas, triagem ligante e estudos de cristalografia de elétrons. Esses métodos podem ter aplicações gerais para os estudos estruturais e funcionais de outras proteínas de membrana.

Resumo

Para estudar a interacção lípido-proteína numa forma reductionistic, é necessário incorporar as proteínas de membrana em membranas de composição lipídica bem definida. Estamos estudando os efeitos de propagação de lipídios-dependentes em um canal de potássio voltagem-dependentes protótipo (Kv), e tem trabalhado procedimentos pormenorizados para reconstituir os canais em sistemas de membrana diferentes. Nossos procedimentos de reconstituição tomar conta de ambos fusão detergente induzida por vesículas e da fusão de proteína / detergente micelas com os lipídios / detergente micelas mistas, bem como a importância de se chegar a uma distribuição de equilíbrio de lipídeos entre a proteína / detergente / lipídio e do detergente micelas mistas / lipídicas. Os nossos dados sugerem que a inserção dos canais nas vesículas lipídicas é relativamente aleatória em orientações, e a eficiência da reconstituição é tão elevado que não foram detectáveis ​​agregados proteicos encontrados em experiências de fraccionamento. Nós utilizamos a reconstituird canais para determinar os estados conformacionais dos canais em diferentes lípidos, gravar actividades eléctricas de um pequeno número de canais incorporados em bicamadas lipídicas planas, a tela para ligandos específicos para a conformação de uma biblioteca de péptido-fago exibida, e apoiar o crescimento dos cristais 2D dos canais em membranas. Os procedimentos de reconstituição descritas aqui pode ser adaptado para o estudo de outras proteínas da membrana em bicamada de lípidos, especialmente para a investigação dos efeitos de lípidos nos canais iónicos dependentes da voltagem eucarióticas.

Introdução

Células materiais taxas e informações com seu ambiente através das funções das proteínas de membrana específicos ^1. Proteínas de membrana nas membranas celulares funcionam como bombas, canais, receptores, enzimas intramembrane, linkers e simpatizantes estruturais através das membranas. As mutações que afetam as proteínas de membrana têm sido relacionado a muitas doenças humanas. Na verdade, muitas proteínas de membrana têm sido os principais alvos de drogas, porque eles são importantes e facilmente acessível nas membranas celulares. É, portanto, muito importante para compreender a estrutura e função de várias proteínas da membrana em membranas, e torná-lo ....

Protocolo

1. Expressão e purificação de KvAP Canal (Figura 1)

1. Trabalho de preparação - dia 0
   1. Enxaguar os frascos de vidro para a cultura bacteriana com água deionizada (DIH ₂ O) e MilliQ _H2O (MQH ₂ O) para remover vestígios de detergente de lavagem de louça em geral.
   2. Autoclave de 1000 ml de meio LB em balões Erlenmeyer de 2,8 L (total de dois litros de cultura aqui como um exemplo). Baixa dureza da água foi encontrada para ser importante para o sucesso da cultura das bactérias transformadas.
   3. Autoclave 100 ml de meio LB em balões de 500 ml
   4. Transformar 60 ul de células competentes XL1-azul com 200....

Resultados

O fluxo geral das experiências para a purificação do canal KvAP em homogeneidade bioquímica está descrito na Figura 1A. Amostras típicas durante a expressão e purificação da proteína é mostrado no gel de SDS-PAGE na Figura 1B. A proteína, após a purificação IMAC é relativamente puro. O rendimento do canal KvAP é de cerca de 1,0 mg / litro de cultura.

Solubilização de vesículas lipídicas com detergentes precisa ser trabalhado para cada par de lipídios contra .......

Discussão

A reconstituição dos canais KvAP em diferentes membranas tem sido utilizado em vários estudos ^8-10. Seguindo a ideia de assegurar a distribuição de lípidos entre detergente / lípido micelas mistas e as micelas mistas de proteína / detergente / lípido, que são capazes de atingir a reconstituição quase completa da KvAP em membranas feitas de diferentes lípidos. Cada canal KvAP tetrameric precisa de aproximadamente 100 moléculas lipídicas para cobrir integralmente o seu domínio transmembrana. A exigência essenci.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tryptone	RPI Corp.	T60060
Extrato de levedura	RPI Corp.	Y20020
NaCl	Fisher	S271-3
Tris Base	RPI Corp.	T60040
Cloreto de Potássio	Fisher	BP366-500
n-Dodecil-β-D-Maltoside	Affymetrix	D322S	N-Octyl-&
#946;-D-Glucoside	Affymetrix	O311
Aprotinina	RPI Corp.	A20550-0.05
Leupeptina	RPI Corp.	L22035-0.025
Pestatina A	RPI Corp.	P30100-0.025
PMSF	SIGMA	P7626
Dnase I	Roche	13407000
Bio-Bead SM-2	Bio-Rad	152-3920
HEPES	RPI Corp.	H75030
POPE	Avanti Lipídios Polares	850757C
POPG	Avanti Lipídios Polares	840457C
CÃES	Avanti Lipídios Polares	870314C
DMPC	Avanti Lipídios Polares	850345C
Biotina-DOPE	Avanti Lipídios Polares	870282C
DOTAP	Avanti Lipídios Polares	grânulos de agarose NeutrAvidin 890890C
	Piercenet	29200
Tubos de diálise	Spectrum Laboratories, Inc	132-570
Pentano	Fisher	R399-1
Decane	TCI America	D0011
MTS-PEG5000	Toronto Research Cemicals	M266501

de Grau Ana