A proteína de levedura nucleóide mitocondrial, Mgm101, é uma proteína de recombinação de tipo rad52 que forma anéis grandes oligoméricas. Um protocolo é descrito para preparar Mgm101 solúvel recombinante utilizando a proteína de ligação à maltose (MBP), acoplado com a estratégia de marcação de permuta catiónica e a cromatografia de exclusão de tamanho.
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Artigo de método
Preparação do Mgm101 recombinação de proteínas por Estratégia Tagging baseado MBP
Neste artigo
Resumo
Resumo
O gene foi identificado MGM101 há 20 anos pelo seu papel na manutenção do DNA mitocondrial. Estudos realizados em vários grupos têm sugerido que a proteína Mgm101 está envolvida na reparação de recombinação do DNA mitocondrial. Investigações recentes têm indicado que Mgm101 está relacionado com a família de proteínas do tipo de recombinação de RAD52. Estas proteínas formam anéis grandes oligómeros e promover a hibridação de moléculas de homólogo de ADN de cadeia simples. No entanto, a caracterização das Mgm101 tem sido dificultada pela dificuldade em produzir a proteína recombinante. Aqui, um processo de confiança para a preparação de proteínas recombinantes é descrita Mgm101. Maltose Binding Protein (MBP), marcado Mgm101 é expressa pela primeira vez em Escherichia coli. A proteína de fusão é inicialmente purificado por cromatografia de afinidade em amilose. Depois de ser libertado por clivagem proteolítica, Mgm101 é separada por cromatografia de troca PAM catiónica. Monodispersas Mgm101 é então obtidopor cromatografia de exclusão de tamanho. Um rendimento de ~ 0,87 mg de Mgm101 por litro de cultura bacteriana pode ser rotineiramente obtidos. O Mgm101 recombinante tem o mínimo de contaminação de ADN. As amostras preparadas são utilizadas com sucesso para a análise da imagem de partículas bioquímicos, estruturais e de Mgm101 único. Este protocolo pode igualmente ser utilizado para a preparação de outros grandes proteínas de ligação de ADN oligoméricas que podem ser deformadas e tóxico para as células bacterianas.
Introdução
A recombinação homóloga é importante para a reparação de quebras de cadeia dupla (DSB) e reticulações intercadeias, e para a re-introdução de garfos de replicação de ADN de replicação colapsadas 1. Na recombinação homóloga convencional, a reacção é catalisada pela central, as recombinases dependentes de ATP, incluindo RecA em procariotas, e Rad51 e Dmc1 em eucariotas 1-3. Estas recombinases formar filamentos nucleoprotéicos em ADNcs, que são essenciais para iniciar a pesquisa de homologia e invasão vertente dúplex dentro de moldes de ADN (Figura 1, painel da esquerda) 4-7. Além do esquema convencional, a recombinação ....
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Protocolo
Estudos anteriores têm mostrado que os primeiros 22 amino-terminais de resíduos de Mgm101 são clivados após a importação para mitocôndrias 19. Para expressão em Escherichia coli, a grelha de leitura aberta MGM101 faltam os primeiros 22 codões é amplificado por PCR e colocados a jusante da sequência malE que codifica a proteína de ligação à maltose (MBP) com uma versão modificada do vector de expressão pMAL-C2E. Isto gera a fusão MBP-Mgm101 com um ligante contendo um local de clivagem para a protease PreScission (Figura 3). O plasmídeo foi construído pela primeira vez através da selecção E. transformantes....
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Resultados
Mgm101 é uma proteína de recombinação RAD52 relacionada nas mitocôndrias. RAD52 tem sido extensivamente estudada pelo seu papel na recombinação do ADN mitocondrial (Figura 1). Mgm101 recombinante podem ser preparados por um procedimento em três passos (Figura 2). Isto é facilitado pela utilização da estratégia de MBP-marcação permite que Mgm101 a ser expresso numa forma solúvel e subsequentemente libertado a partir da etiqueta por clivagem proteolitica (Figura 3).
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Discussão
Foi um desafio para a produção de um estábulo, nativo da proteína recombinante a partir de E. Mgm101 coli, possivelmente devido à sua insolubilidade em células bacterianas. Neste relatório, que mostram que a estratégia de fusão MBP-permite que a proteína seja expressa com um nível razoavelmente elevado. Por meio da coloração de microscopia electrónica de transmissão negativo e cromatografia de exclusão de tamanho, mostrámos previamente que a proteína de fusão MBP-forma oligómeros uniformes in vitro.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos Stephan Wilkens ajuda para microscopia eletrônica de transmissão. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grant R01AG023731.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Vetor de expressão pMAL-c2E | New England Biolabs | #N8066S | |
| Protease de pré-cisão | GE Healthcare Life Sciences | #27-0843-01 | |
| BL21-CodonPlus(DE3)-RIL células | Strategene | #230245 | |
| Leupeptina | Roche Applied Science | #11034626001 | |
| Pestatina | Roche Applied Science | #11359053001 | |
| Fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) | Roche Applied Science | #10837091001 | |
| DNAse I | Sigma | #DN25-1G | |
| Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) | Roche Applied Science | #11411446001 | |
| Resina de amilose | New England Biolabs | #E8021L | |
| coluna de cromatografia | Econo-ColumnBIO-RAD | #7372512 Cartucho | |
| Bio-Scale Mini Macro-Prep High S (1 ml) | BIO-RAD | #732-4130 | |
| VIVASPIN 15R Coluna de centrifugação de ultrafiltração (10.000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS15RH02 | |
| Coluna de grau de preparação Superose 6 | Amersham Bioscirnces | #17-0489-01 | |
| Coluna de centrifugação de ultrafiltração VIVASPIN 6 (5.000 MWCO) | Sartorius Stedium |
Referências
- San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).
- Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli r....
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Reimpressões e permissões
