Nós apresentamos um protocolo simples de se obter filmes de microscopia de fluorescência de crescimento de células de levedura, e um pacote de software baseado em GUI para extrair dados de séries temporais de uma única célula. A análise inclui linhagem automatizada e divisão atribuição tempo integrado com inspeção visual e curadoria manual de dados controladas.
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Artigo de método
Aquisição de fluorescência Filmes Time-lapse da levedura de brotamento e análise da dinâmica de células simples utilização de enxertos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Microscopia de lapso de tempo de fluorescência tornou-se uma ferramenta poderosa no estudo de muitos processos biológicos ao nível de uma única célula. Em particular, os filmes que descrevem a dependência temporal da expressão gênica fornecer insights sobre a dinâmica de sua regulamentação, no entanto, existem muitos desafios técnicos para a obtenção e análise de filmes de fluorescência de células individuais. Descrevemos aqui um protocolo simples, usando um dispositivo de cultura microfluídicos disponível comercialmente para gerar esses dados e uma interface baseada em MATLAB gráfica do usuário (GUI) baseada em software para quantificar as imagens de fluorescência. Os segmentos de software e células pistas, permite ao usuário curadoria visualmente erros nos dados e automaticamente atribui linhagem e os tempos de divisão. A GUI analisa a série mais tempo para produzir vestígios de células inteiras, bem como as suas primeira e segunda derivadas de tempo. Enquanto o software foi concebido para S. cerevisiae, a sua modularidade e versatilidade deve permitir que ele tó servir como uma plataforma para o estudo de outros tipos de células, com poucas modificações.
Introdução
Análise de uma única célula da expressão gênica tem promovido a nossa compreensão de muitos aspectos da regulação gênica. Instantâneos estáticos de expressão repórter fluorescente utilizando citometria de fluxo ou microscopia de fornecer informações úteis sobre a distribuição de expressão de uma única célula, mas falta a história ea evolução dos dados de séries temporais obrigados a informar diretamente a dinâmica de expressão gênica. Microscopia de lapso de tempo de fluorescência apresenta um meio para obter ambas as medições de uma única célula e sua história. As várias técnicas experimentais e analíticas foram desenvolvidos para a obtenção de filmes e quantificar ....
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Protocolo
1. Obter Filmes microscopia de fluorescência de células de levedura simples que crescem em uma Câmara Microfluidic
- Inocular 1 ml de meio SC (meio sintético definido, com 2% de glucose e complemento completo de aminoácidos) com células de uma placa recentemente crescente, e incubar a cultura durante a noite ~ 16 horas sobre um tambor de rolo a 30 ° C. Preparar a cultura de tal modo que o último é OD 600nm ~ 0,1 para um crescimento de fase log precoce.
- Dilui-se a cultura iniciadora, conforme necessário e crescerem de 1 ml num tubo de ensaio fresco um adicional de 6-8 horas a OD 600 nm = 0,1. Isto proporciona células que cresce....
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Resultados
Uma experiência realizada com sucesso e analisados trará séries temporais principalmente contínuo para células inteiras individuais com surgimento bud realisticamente atribuído e os tempos de divisão. Como exemplo, foi realizado o protocolo anteriormente referido, com uma estirpe haplóide de levedura expressando uma cópia integrada de proteína fluorescente Cerúlea (PCP), impulsionada pela constitutivo promotor ADH1 observar como o crescimento e expressão global pode variar ao longo do tempo em célula.......
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Discussão
O protocolo acima descreve um método simples de se obter e analisar fluorescência dados de séries temporais com experiência limitada em microfluídica ou no desenvolvimento de software. Ele permite a obtenção de time-lapse filmes de fluorescência das células de levedura de solteiro; extrair o tamanho da célula relevante e medições de expressão; rastreamento cura e atribuições da linhagem, e analisar o comportamento de células inteiras ao longo do tempo usando um dispositivo cultura microfluídicos comercialmente disponíve.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos Emily Jackson, Joshua Zeidman, e Nicholas Wren para comentários sobre o software. Este trabalho foi financiado pelo GM95733 (para NM), BBBE 103.316 e MIT fundos de inicialização (para NM).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de perfusão de levedura Y04C | CellAsic | Y04C-02 | |
| ONIX Plataforma de perfusão microfluídica | CellAsic | EV-262 | |
| Axio Observer.Z1 Microscópio | Zeiss | ||
| Plan-Apochromat 63x/1.40 Objetiva DIC de óleo | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| Câmera Cascade II EMCCD | Photometrics | ||
| Lâmpada de arco de halogeneto metálico Lumen 200 | da PRIOR Scientific | ||
| filtros de emissão e excitação Chroma | Technology Corp | conjunto #89006 | Usado para YFP (Vênus/Citrino), CFP (Ceruleano), RFP (mCherry/tdTomato) |
| Controlador MAC 5000 e rodas de filtro | Ludl Electronic Products | ||
| MATLAB R2011a | Mathworks | A versão de 64 bits lida com arquivos de dados grandes melhor do que a de 32 bits |
Referências
- Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene Regulation at the Single-Cell Level. Science. 307 (571....
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Reimpressões e permissões
