Artigo de método

Engenharia de Tecidos de um 3D Humano

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DOI:

10.3791/50460

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6 de agosto de 2013

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1Department of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital Würzburg

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Métodos para criar tecidos tumorais 3D humanos como sistemas de teste são descritos. Estas tecnologias são baseadas num descelularizado Biológica vascularizada andaime (BioVaSc), células humanas primárias e uma linha de células tumorais, que podem ser cultivadas em condições estáticas, bem como sob condições dinâmicas de um bio-reactor de fluxo.

Resumo

O câncer é uma das principais causas de morte em todo o mundo. Estratégias terapêuticos actuais são predominantemente desenvolvida em sistemas de cultura em 2D, que reflectem adequadamente as condições fisiológicas in vivo. Matrizes 3D biológicos fornecer células de um ambiente no qual as células podem auto-organizar-se, permitindo que o estudo da organização do tecido e da diferenciação celular. Tais andaimes podem ser semeado com uma mistura de diferentes tipos de células para estudo de interações célula-célula 3D diretos. Para imitar a complexidade 3D ​​de tumores cancerosos, o nosso grupo desenvolveu um sistema de teste in vitro tumor 3D.

Nossos modelos 3D sistema de teste do tecido a situação in vivo de tumores malignos da bainha dos nervos periféricos (MPNSTs), que estabeleceu com a nossa descelulada segmento jejunal porcino andaime vascularizado biológico (BioVaSc). No nosso modelo, reseeded uma matriz BioVaSc modificado com fibroblastos primários, células endoteliais microvasculares (mvECs) e a linha de células de tumor S462. Para a cultura estática, a estrutura vascular do BioVaSc é removido e o andaime remanescente é cortada de um lado aberto (Submucosa do Intestino Delgado SIS-MUC). A matriz resultante é então fixado entre dois anéis metálicos (coroas de células).

Outra opção é a cultura da célula-semeado SIS-Muc num sistema de bioreactor de fluxo que expõe as células ao cisalhamento. Aqui, o bioreactor está ligada a uma bomba peristáltica num incubador de auto-construída. Um computador regula o oxigênio e nutrientes através de parâmetros como a pressão arterial, temperatura e vazão. Esta configuração permite uma cultura dinâmica, com ou pulsátil regulado por pressão ou fluxo constante.

Neste estudo, foi possível estabelecer com sucesso tanto um sistema de cultura 3D estática e dinâmica para MPNSTs. A capacidade de modelar os tumores de câncer em um ambiente 3D mais natural permitirá a descoberta, teste e validação defuturos fármacos em um modelo semelhante à humana.

Introdução

Novos produtos farmacêuticos devem ser validados em relação à sua qualidade, segurança e eficácia antes da autorização de mercado. Até o momento, experimentos com animais são o método padrão para o teste e validação de drogas. No entanto, devido às diferenças específicas de espécies, as experiências com animais, muitas vezes não avaliar exaustivamente o efeito dos compostos em humanos 1. Por esta razão, é importante para gerar modelos de tecidos humanos que podem ser utilizados para testes in vitro de novos medicamentos e substâncias.

Um dos focos do nosso grupo é a criação de modelos em teste in vitro com o nosso andaime vascularizado biológico (BioVaSc) 2,3. O BioVaSc pode ser usado como um sistema de matriz em 3D estático ou dinâmico. Para a cultura estática, o segmento jejunal suína descelulada (Small Intestinal Submucosa SIS-MUC) é colocado em uma pastilha de metal para reseeding celular. Várias células, tais como o câncer e as células endoteliais podem ser cultivadas no cadafalso.

Para a cultura dinâmica, o BioVaSc está ligado a um sistema de bioreactor de fluxo que se aplica em toda a vasculatura ou em toda a superfície do andaime. Biorreatores atuais implementar estímulos biológicos, mecânicos ou elétricos que agem sobre a diferenciação ou proliferação de células 4. Para biorreatores no campo da engenharia de tecidos, o conceito básico é o de simular as condições do corpo humano. Em que, as células são fornecidos um ambiente natural em que eles possam interagir uns com os outros e a sua matriz extracelular circundante. Para a produção de sistemas de teste in vitro ou de transplantes, a capacidade de imitar o ambiente natural das células com uma estrutura de suporte adequada e um sistema de bioreactor é crítico 5. Portanto, os dispositivos mais complexos e tecnicamente exigentes devem ser desenvolvidas a fim de cumprir essas tarefas 6.

Além disso, é possível usar o nosso andaime para o establishment de um modelo vascularizado devido às estruturas tubulares conservados, os quais incluem a alimentação da artéria, veia, e o leito capilar de ligação. Todas as células de suíno têm de ser removidos por descelularização química, mecânica e enzimática, e o andaime esterilizado-gama. As estruturas vasculares tubulares restaurado pode ser subsequentemente re-semeadas com células endoteliais microvasculares humanas, utilizando um bioreactor de perfusão de recirculação 7, que imita os parâmetros biomecânicos e / ou bioquímicos, tais como pH, temperatura, pressão, o fornecimento de nutrientes e de remoção de desperdícios 6. A re-endotelização de estruturas tubulares cria um vaso sanguíneo equivalente humano no andaime 3,7 colagenosa. No passo seguinte, a superfície dos antigos lúmen (mucosa) podem ser semeadas com células humanas primárias para estabelecer co-culturas 3,7,8.

Neste estudo um sistema de teste tumor 3D é criado pelo co-cultura de uma linha de células tumorais com rua principalcélulas romal em condições estáticas e dinâmicas sobre o SIS-Muc.

Protocolo

1. Decelularização do BioVaSc

  1. Lave o sistema vascular do segmento jejunal suína via de acesso arterial canulada e lúmen intestinal com PBS -. Repita até que esteja completamente limpa.
  2. Prepare um tanque de vidro diâmetro 200 mm 4 adaptadores e conectá-los através de tubos de silicone para a bomba peristáltica (Ismatec). A pressão da unidade de controle pode ser monitorizada por meio de um sensor de pressão que está conectado a uma cúpula descartável estéril (ver Figura 1).
  3. Preencha garrafas de reservatório com solução decellularization (DZ) e verifique o sistema de tubulação para possíveis bolhas de ar.
  4. Conecte o lúmen intestinal com abraçadeiras aos conectores de vidro para o fluxo luminal. Bomba de 500 ml de solução em DZ acesso arterial vermelho (Figura 1B), do sistema vascular. Interromper o processo de bombeamento a cada 15 minutos, logo a pressionar manualmente o lúmen intestinal inteiras.
  5. Durante o decellularizatino processo, a pressão da solução tampão deve ser entre 80 - 100 mm de Hg, modelada após a pressão natural do sangue.
  6. Lave o BioVaSc com PBS - até que ele esteja livre de restos celulares ("completamente branco").
  7. Encha o BioVaSc completamente com solução DZ e incubar-lo submergir em solução DZ durante a noite a 4 ° C em balanço shaker.
  8. Repita o passo 1.6.
  9. Coloque a BioVaSc em solução de DNase e incubar durante a noite a 4 ° C agitando agitador.
  10. Remover solução DNase e enxágüe com tampão de lavagem.
  11. γ-esterilização com 25 kGy

2. Os diferentes tipos de células

2.1 Isolamento de células primárias humanas dérmicas microvasculares endoteliais (mvECs) e fibroblastos

  1. Corte biópsia da pele (de preferência prepúcio) em tiras de 2-3 mm de largura, com bisturi e lavá-los 3x com PBS - solução.
  2. Cubra o tecido com solução Dispase e incube-o para 16 - 18 horas a 4 ° C.
  3. Epiderme Separe derme com duas pinças e transferir tanto separadamente em placas de Petri cheias de PBS +.
  4. Derme Lavar tiras 1x com Versene.
  5. Adicionar 10 ml de solução de tripsina / EDTA para as tiras da derme e incube-na incubadora durante 40 min.
  6. Parar a reacção enzimática imediatamente com 1% de FCS.
  7. Transferir tiras de pele de uma placa de Petri cheia de VascuLife e riscar cada tira com o bisturi 8x cada lado, a adição de um pouco de pressão.
  8. Transferência da suspensão de células produzidas por meio de um filtro de células para um tubo de centrífuga e lavar 3x coador de células com VascuLife.
  9. Centrifuga-se o tubo a 1.200 g durante 5 min e ressuspender o sedimento de células com VascuLife.
  10. Para isolar os fibroblastos, derme costeleta tiras em pequenos pedaços usando o bisturi.
  11. Adicionar 10 ml de solução de colagenase a derme pedaços.
  12. Incubar lo por 45 minutos na incubadora, em seguida, centrifugar-lo e remova cuidadosamente supernatant.
  13. Lave 1x de pelotização com DMEM + 10% SFB +% Penstrep, centrífuga-lo e remova cuidadosamente o sobrenadante.
  14. Ressuspender o sedimento em meio de cultura e transferi-lo para uma garrafa de cultura T75 para permitir que as células a crescer para fora do tecido.

Linha 2.2 Tumor celular S462

A linha de células tumorais S462 (gentilmente cedido pelo Dr. Nikola Holtkamp, ​​da Universidade Charité de Berlim Medicine) foi gerada a partir de um tumor maligno da bainha do nervo periférico de uma paciente com a síndrome de predisposição hereditária do tipo tumor neurofibromatose 1 9. S462 são cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FCS. Médio tem de ser mudado cada 2 - 3 dias. Depois de uma semana, as células têm que ser divididos.

3. Tumor Sistema de Teste: Static Condições Cultura comparado à cultura dinâmica em sistemas biorreator

  1. Corte o tubular SIS-Muc abrir de um lado e corrigi-lo entre dois anéis de metal (coroas celulares, 10 mm de diâmetro, auto constructed). Cubra o SIS-Muc em meio de cultura de células durante a noite.
  2. Células de sementes isolado no número de células definidos (veja abaixo) em um ou ambos os lados do SIS (mono ou co-cultura set-up).
    1. Semente de 8000 células / cm 2 de mvECs primárias em um volume total de 100 ul para a superfície basolateral do SIS (ex serosa). 3 horas depois encher o poço com meio para assegurar uma cultura submersa.
    2. Permitir que as células endoteliais a aderir durante 3 dias. Virar o sistema de cultura estática, 180 ° e transferi-lo para uma placa de 12 poços.
    3. Semente de uma mistura de fibroblastos dérmicos primários (8000 células / cm 2) e as células tumorais (15.000 células / cm 2) dentro de um volume total de 500 mL sobre a superfície apical do SIS (o lado dos ex-lúmen).
    4. Permitir que as células a aderir durante 3 horas e encher o poço com meio (cultura submersa, média: 50% Vasculife + 50% DMEM suplementado com 10% de FCS).
    5. O sistema de teste do tumor é cultivada sob condições estáticas umt 37 ° C, 5% de CO 2 na incubadora durante mais 14 dias. Alterar o meio de cultura a cada 2 - 3 dias.
  3. Para a cultura dinâmica, corrigir o SIS-Muc entre dois anéis de metal e sementes mvECs primários como descrito em 3.2.1. Após 3 dias remover o SIS-Muc dos anéis de metal e inserir a membrana para o reactor de fluxo (ver Figuras 2C e 2D). Aplicar a fibroblastos dérmicos e as células de tumor primário com uma seringa e da cânula para a matriz no bioreactor, e permitir que as células a aderir durante 3 h antes de encher o sistema de biorreactor com meio de cultura.
  4. Nos dias seguintes condições dinâmicas da cultura, com fluxo constante de meio (3,8 ml / min, 37 ° C, e 5% de CO 2) pode ser iniciada. A cultura dinâmica é mantida por 14 dias, o meio de cultura é mudado depois de 7 dias.
  5. A configuração do teste dinâmico é cultivada em uma incubadora de construção própria que fornece fluxo de mídia através de uma bomba ea temperatura necessária e CO 2 Conteúdo.

4. Métodos de caracterização para Análise

4.1 Fixação e parafina-incorporação da matriz de colágeno semeadas

  1. Para (imuno-histológicos) caracterizações remover o meio de cultura e fixar o tecido com paraformaldeído a 4% para 2 horas.
  2. Retirar 4% de paraformaldeído e transferir o SIS a partir da inserção de metal para uma cassete de tecido incorporação. Regue o tecido para remover fixador restante e desidratar por infiltração de parafina.
  3. Antes de incorporar em um bloco de parafina, corte o SIS em 2-3 fatias e coloque-as em um metal base de molde cheio de parafina de modo que as superfícies cortadas de bruços. Adicionar a cassete de tecido no topo do molde como um suporte.
  4. Cortar fatias de 5 mM e eles flutuam sobre um banho de água a 40 ° C para endireitar, em seguida, montar as lâminas em lâminas de vidro adequados. Lâminas não revestidos são usados ​​para H & E manchas, lâminas revestidas com polilisina para coloração imuno melhorar anexo.Deixe as fatias secar completamente.
  5. Derreta a parafina, retire-o com xileno e hidratar fatias para após coloração.

4.2 Coloração

  1. Os cortes reidratados pode ser manchado com Hematoxilina / Eosina como uma coloração visão padronizada.
  2. Para a coloração immunhistological, fixa e fatias de tecido infiltrado com parafina deve ser submetido a uma recuperação de antigénios para permitir que os anticorpos para reconhecer e ligar-se aos seus epitopos específicos. Assim, lâminas desparafinizadas e re-hidratadas são colocadas numa panela de vapor com tampão citrato aquecido (pH 6.0) durante 20 min.
  3. Lâminas de transferência para tampão de lavagem (0,5 M tampão TBS + 0,5% Tween) e fatias de círculo com uma caneta PAP para minimizar o volume necessário para as soluções de coloração.
  4. Coloque o slide em uma câmara de umidade. Para garantir uma visualização mediada por peroxidase específico de antigénio-anticorpo de ligação, a peroxidase endógena deve ser saturada com 3% de peróxido de hidrogénio.
  5. ANTIB primáriadiluições ody são aplicados às fatias, incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente e cuidadosamente lavado com tampão de lavagem.
  6. Para a detecção de ligações antígeno-anticorpo específicos do Ultra Visão Quanto Detection System HRP DAB (Thermo Scientific) é usado de acordo com o protocolo recomendado.
  7. Os núcleos são contrastadas com hematoxilina durante 1 min.
  8. As lâminas são montadas com um meio aquoso, secou-se, e visualizados utilizando um microscópio invertido.

Resultados

Como mostrado na Figura 1B, que descelularizados o segmento de jejuno de porcino (cerca de 2 m de comprimento e 20 mm de diâmetro) com estruturas tubulares preservadas da rede capilar. Após química, enzimática e mecânica descelularização, obteve-se um andaime colagénio I / III, que pode ser utilizado para a cultura de células em 3D. Um teste de Feulgen foi realizada para demonstrar o grau de pureza (não há vestígios de ADN) da matriz (dados não mostrados).

As Figuras 2A e 2B mostram a cultura estática de SIS-Muc assegurado pelas coroas de células. Fixamos o SIS-Muc em um biorreator desenvolvido em casa (Figura 2C) para a cultura dinâmica. Figura 2D ilustra o fluxo dinâmico simulado através da câmara do biorreator. O bio-reactor é colocado em uma incubadora sistema auto-construída e ligado com uma bomba peristáltica. Esta configuração permite que uma cultura dinâmica com qualquer fluxo pulsátil regulada por pressão ou c fluxo onstant.

A Figura 3 apresenta uma visão geral da linha S462 estaticamente cultura de células tumorais em monocultura 2D (Figura 3A) e em 3D co-cultura (Figuras 3B-3D). Figura 3B mostra a cultura triplo de células tumorais S462 e fibroblastos primários no lado apical do SIS -MUC (ex-lateral lúmen interno) e MVEC no lado basolateral (lado serosa anterior). A identificação dos diferentes tipos de células é possível através da coloração de marcadores específicos do tipo de células, tais como o factor de von Willebrand para rotular MVEC (Figura 3C). As células S462 positivos de p53 podem ser distinguidas a partir dos fibroblastos primários da p53 negativa (Figura 3D) e a distribuição 3D de células podem ser analisadas. Figura 4 mostra colorações equivalente à figura 3 da cultura triplo dinamicamente cultivadas.

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Figura 1. Decelularização set-up. (A) biorreator e bomba set-up para a descelularizante BioVaSc, monitorado por um PC. (B) descelularizado BioVaSc em tanque de vidro. O lúmen arterial e a entrada são ligados aos adaptadores. .

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Figura 2. Sobre a opinião dos diferentes cultura set-ups. (A) vista de seção CAD do sistema de cultura estática em microtitulação placa, (B) pastilhas de metal para a cultura estática, (C) de simulação de fluxo médio (campo de velocidade [m / s]) para a cultura dinâmica da pálpebra superior do biorreator fluxo , (D) biorreator de fluxo para cultura dinâmica ligada à bomba peristáltica. Clique aqui para ver maior figura

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Figura 3. Visão geral da caracterização imuno do modelo estático tumor 3D. (D) mancha de Hematoxilina do estaticamente cultivadas cultura mono-2D de células S462 sobre uma lâmina permanox, (B) H & E mancha do estaticamente cultivadas cultura tripla 3D, setas marcam células endoteliais, (C) A coloração por imuno para o factor de von Willebrand, (D ) coloração imuno para p53. Clique aqui para ver maior figura

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Figura 4. Visão geral da caracterização imuno do modelo dinâmico tumor 3D. (A) H & E mancha do dinamicamente culta cultura triplo 3D, setas marcar células endoteliais, (B) coloração imuno para fator de von Willebrand, (C) coloração imuno para p53. Clique aqui para ver maior figura

Discussão

Ao comparar os sistemas de cultura em 2D e 3D em pesquisa do tumor, sistemas 3D, apesar de ser a abordagem mais caro, provaram para imitar as condições em microambientes biológicos melhor. Pode ser mostrado que algumas células de tumor crescer muito mais lenta em cultura em 3D de uma cultura em 2D comum 12, o qual está em conformidade com a situação em tumores reais. Bissell e colaboradores mostraram no seu trabalho que o comportamento de células cancerígenas da mama reflecte a situação in vivo, incluindo a morfologia celular e de sinalização, de forma mais precisa, quando uma cultura 3D dentro de uma matriz oferece as interacções célula-ECM. Além disso, eles enfatizaram a importância do meio extracelular em 3D, demonstrando que as mudanças nas interações ambientais levou à reversão das células malignas a um fenótipo normal. Além disso e mais importante ainda, estes resultados podem também ser confirmada em modelos animais in vivo 10,11.

ONTEÚDO "> A comparação direta de experimentos in vivo em animais e em modelos in vitro de tecido revela vantagens e desvantagens em ambos os sistemas. Uma das vantagens de modelos in vitro é a permissão de um real-time muito melhor ou imagem fixa por microscopia. Uma limitação é que eles imitam condições estáticas ou de curto prazo, ao passo que sistemas in vivo, muitas vezes o progresso. A atual falta de vascularização e transporte normal de pequenas moléculas, resposta imune do hospedeiro, e outras interações célula-célula são outras desvantagens de modelos in vitro 12. Portanto, 3D em sistemas in vitro, tal como apresentado neste estudo oferecem um complemento promissor para experimentos com animais. Eles fornecem uma melhor comparabilidade com o organismo humano e, portanto, minimizar erros de interpretação experimentais. Biomiméticos em sistemas modelo vivo será, portanto, tornam-se mais relevantes para estudar como o câncer e metástase é dependente em condições micro-ambientais que regulam tumorigenesis 11.

O nosso estudo mostra que o ambiente 3D fornecida pelo SIS-Muc conduz a uma formação mais tumoral tecido de células, a qual não é observada na cultura de células em 2D comum (ver Figura 3A). Além disso, o uso de células primárias derivadas de biópsias de tumores é um passo muito importante para a medicina personalizada, uma disciplina que tem por objetivo identificar o melhor tratamento, dependendo das necessidades individuais do paciente. A incorporação de células primárias de tumor específicos do paciente, isolado a partir de material de biopsia permitirá em testes in vitro de estratégias terapêuticas. Tais sistemas de teste, será possível investigar diferentes drogas e suas combinações, com um tempo de e rastreio de alto rendimento de poupança de custos. Além disso, a integração das células do estroma associado a tumores, como mostrado neste estudo, é importante para a abordagem personalizada, uma vez que a progressão influências do microambiente do tumor um tumor de 13 e pode revelar-se como suitabalvo terapêutico le.

Como alternativa a uma abordagem personalizada, o nosso modelo de tumor pode ser modificado para servir como um sistema de teste do tumor generalizada pela incorporação de linhas de células tumorais estabelecidos. Esta é uma adaptação promissor para fins de pesquisa básica. Para ambos os testes de drogas aproxima da presença de uma estrutura vascular necessária para testar a distribuição e absorção de substâncias terapêuticas. A matriz SIS-Muc permite a semeadura basolateral com MVEC primário para estudos de captação de barreira, o repovoamento das estruturas vasculares preservadas da BioVaSc irá melhorar ainda mais o estudo de entrega de drogas.

A fim de criar modelos de tecidos, uma matriz biodegradável 3D pode ser utilizado como uma estrutura para a co-cultura de diferentes tipos de células 14. O uso de tais matrizes 3D é frequentemente limitada pela falta de uma vascularização funcional. Este problema pode ser resolvido pela utilização do BioVaSc, que oferece preservada str vaso sanguíneouctures, o qual pode ser re-semeadas com células endoteliais. Além disso, o BioVaSc fornece componentes extracelulares, que garantem a aderência das células e facilitar a diferenciação de tecidos. Ele também permite que a função específica do tecido de longa data de bioartificial tecidos 3D 7,8,15. O pré-requisito para a engenharia dos substitutos vasculares funcionais é a imitação de fisiológica humana e condições biomecânicas. Portanto, sistemas de biorreatores, que pode implementar estes requisitos in vitro, são de extremo interesse para a criação de modelos de tumores biológicos.

A combinação do BioVaSc, a tecnologia de bio-reactor e co-cultura de diferentes tipos de células é um método muito promissor para gerar tecidos de tumor vascularizado, o que permitirá o estudo de mecanismos relevantes para a progressão do cancro, tais como angiogénese e metástase. Vemos tais modelos de tumor como uma abordagem promissora para complementando os estudos animais, fornecendo um equivalentepara a fisiologia do tumor humano.

Divulgações

Autores têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Jan Hansmann (Fraunhofer IGB, Stuttgart) por seu apoio técnico para desenvolver biorreatores e incubadora biorreator.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de colagenaseSERVA17454(500 U / ml)
Solução de dispaseGibco17105-041(2,0 U / ml)
DMEM, PAA com alto teor de glicoseG0001,3010
DNaseROCHE10104159001200 mg dissolvido em 500 ml PBS+ + solução PenStrep DZ a 1%
Roth3484.234 g de sódio Desoxiquelato, em 1 L Água ultra-pura
FCSLONZADE14-801F
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRPDCSPD000KIT
transdutor de pressão médicaMEMSCAPSP844
camundongo monoclonal anti-humano Von Willebrand FatorDAKO CytomationM0616Clone F8/86 0,12 μ g/ml
de camundongo monoclonal anti-humano p53DAKO CytomationIS616Clone DO-7 bomba
peristálticaIsmatec
cúpula descartável estérilMEMSCAP844-28
Solução de tripsina / EDTAPAAL11-0030,05%
VascuLife (VEGF-Mv)LifelineLL-0003
VerseneGibco15040-033
pronta para uso

Referências

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