É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Transplante para a câmara anterior do olho para longitudinal, não-invasivo

13.2K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/50466

⸱

10 de março de 2013

Neste artigo

Resumo

Uma nova abordagem combinando transplantação intra-ocular e microscopia confocal permite longitudinal, não-invasivo de imagem em tempo real, com uma única célula de resolução dentro dos tecidos enxertados In vivo. Demonstramos como transplantar ilhéus pancreáticos para dentro da câmara anterior do olho do rato.

Resumo

Intravital imagem surgiu como uma ferramenta indispensável na pesquisa biológica. No processo, muitas técnicas de imagiologia têm sido desenvolvidos para estudar diferentes processos biológicos em animais não-invasiva. No entanto, uma das principais limitações na técnica existentes modalidades de imagens intravital é a incapacidade de combinar não-invasivos de imagem, com as capacidades longitudinal de uma única célula de resolução. Mostramos aqui como o transplante para a câmara anterior do olho contorna limitação significativa tal que oferece uma plataforma versátil experimental que permite a não-invasivos de imagem, com a resolução longitudinal celular in vivo. Demonstramos o procedimento de transplante em ratinhos e proporcionam resultados representativos utilizando um modelo com relevância clínica, nomeadamente o transplante de ilhéus pancreáticos. Além de permitir a visualização directa de uma variedade de tecidos transplantados para a câmara anterior do olho, esta abordagem fornece uma plataforma para Screedrogas n realizando acompanhamento a longo prazo eo acompanhamento em tecidos-alvo. Devido à sua versatilidade o transplante, o tecido / célula para dentro da câmara anterior do olho, não só as terapias de transplante benefícios, estende-se a outras aplicações in vivo para o estudo de processos fisiológicos e patológicos tais como o cancro e a transdução do sinal ou o desenvolvimento da doença auto-imune.

Introdução

Os avanços na microscopia intravital revelaram fenómenos fisiológicos não preditos por estudos in vitro 1. Isto realça o desafio na tradução resultados obtidos por métodos in vitro convencional para o animal vivo. Na última década, a visualização de tecidos em animais vivos foi consideravelmente melhorada por avanços tecnológicos em modalidades de imagem 2, 3, 4, 5, 6. Isto estimulou a necessidade de abordagens de imagiologia in vivo, com aplicação possível em modelos animais experimentais, para permitir a visualização de tecidos-alvo longitudinal de forma não invasiva.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

O procedimento seguinte é realizado sob a estereoscópio em 2 passos, o primeiro passo envolve o carregamento das ilhotas para dentro da cânula e a segunda etapa é o transplante de real no ACE. Todos os procedimentos realizados em animais foram aprovados pelo cuidado com os animais institucional e comissão de uso (IACUC), da Universidade de Miami.

1. Ilhotas de carga em cânula para Transplante

  1. Centro das ilhotas no prato de cultura girando o prato em círculos mais estreitos.
  2. Desligar a cânula da "reservatório" e colocar a cânula eo tubo de ligação sobre uma superfície limpa. O reservatório pode ser feito de uma ponta d....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Existem alguns parâmetros que definem um transplante "bom". Um transplante é um bom que prossegue sem hemorragia ao fazer a incisão, como pode ser visto no vídeo. Sangramento é impedido / minimizada por penetrar apenas a ponta do bisturi (agulha) para dentro do ACE (figura 3a). Isso também irá ajudar a evitar o contato e punção da íris. Ele também irá garantir uma pequena incisão que vai curar muito bem sem causar nebulosidade da córnea ao longo do tempo (Figura 3c, d). Outro .......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Ilhéus pancreáticos de murino foram isolados usando a digestão com colagenase seguido por purificação em gradiente de densidade, tal como descrito previamente 33. Ilhotas isoladas foram cultivadas durante a noite antes do transplante. Embora isto possa não ser necessário, é recomendado para permitir que as ilhotas para recuperar do procedimento de isolamento. Isto é crítico, quando é realizado o transplante em receptores diabéticos uma vez que irá assegurar o transplante de ilhéus sobreviventes / robustas.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

PO.B. é um dos fundadores da empresa de biotecnologia Biocrine, que vai usar a câmara anterior do olho como uma plataforma de serviços comerciais. AC é sobre a patente proteger esta tecnologia.

Agradecimentos

Reconhecemos os drs. Camillo Ricordi, Antonello Pileggi, R. Damaris Molano, Stephan Speier e Daniel Nyqvist para discussões frutíferas. Agradecemos também Eleut Hernandez e Diego Espinosa-Heidmann para assistência técnica, e Mike Valdes e Margaret Formoso ajuda com gravação de vídeo. Byron Maldonado gravados, editados e produziu o vídeo final. Apoio à pesquisa foi fornecido pelo Instituto de Pesquisa do Diabetes Foundation ( www.DiabetesResearch.org ), o NIH / NIDDK / NIAID (F32DK083226 a MHA; NIH RO3DK075487 a AC; U01DK089538 para PO.B.). Apoio à pesquisa adicional para PO.B foi fornecido através de fundo....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do reagente Companhia Número de catálogo Descrição / Comentários
IsoTHESIA (isoflurano) Buttler Abastecimento Saúde Animal 11695-6775-2 99,9% de isoflurano / ml
Ketaset (ketamina HCL) Fort Dodge Animal Health 0856-2013-01 Anestesia injetável alternativa
Beprenex (buprenorfina HCL) Reckitt Benckiser Saúde (UK) Ltd. 12496-075-7-1 0,3 mg / ml
Eritromicina pomada oftálmica USP, 0,5% Akron 17478-070-35 Aplicada profilaticamente a olho transplantado
Cloreto de Sódio a 0,9% (Solução salina) Hospira Inc. 0409-7983-03 Para injecção iv. Estéril
PBS Gibco 10010-023 1X. Estéril
CMRL médio 1066 Cellgro 98-304 CV- Complementada, modificação CIT. Meios preferidos para ilhotas

Referências

  1. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem. Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
  2. Leibiger, I. B., Caicedo, A., Berggren, P. O.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Transplante de Câmara AnteriorTransplante de Ilhotas PancreáticasImagem do Olho de CamundongoImagem In Vivo LongitudinalTécnica de Imagem IntravitalProcedimento de Carregamento de CânulaDriver de Seringa MotorizadoMétodo de Incisão CorneanaEnxerto de Tecido Ocular