Medimos a libertação da tensão num axónio que foi parcialmente lesionada com um dissecador de laser através da medição simultânea de espectroscopia de força realizado em uma sonda opticamente preso aderida à membrana do axónio. O protocolo experimental desenvolvido avalia a aderência do axónio para o substrato de cultura.
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Artigo de método
Medição da tensão Lançamento Durante Laser Induced Axon lesão axonal Avaliar Adesão ao substrato em piconewton e resolução de milissegundos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A formação de ligações funcionais em uma rede neuronal em desenvolvimento seja influenciado por sinais extrínsecos. O crescimento de neurite de neurônios em desenvolvimento está sujeita a sinais químicos e mecânicos, e os mecanismos pelos quais ele sente e responde a sinais mecânicos são mal compreendidos. A elucidação do papel das forças na maturação das células irá permitir a concepção de andaimes que pode promover a adesão celular e o acoplamento do citoesqueleto ao substrato, e, por conseguinte, melhorar a capacidade de diferentes tipos neuronais para regenerar após uma lesão.
Aqui, nós descrevemos um método para aplicar medidas de espectroscopia de força simultâneos durante a laser lesão celular induzida. Medimos liberar a tensão no axônio parcialmente lesada por rastreamento interferométrico simultânea de uma sonda ótica preso aderido à membrana do axônio. Nosso protocolo experimental detecta a liberar a tensão com a sensibilidade piconewton, ea dinâmica da liberação de tensão noresolução de tempo de milissegundos. Por isso, oferece um método de alta resolução para estudar como o acoplamento mecânico entre as células e os substratos podem ser moduladas por tratamento farmacológico e / ou propriedades mecânicas distintas do substracto.
Introdução
A microscopia óptica é um dos sistema de imagiologia menos invasivas disponíveis para observar as células vivas. Com a exploração de efeitos, tais como pressão de radiação (como pinças ópticas 1), ou fluxo de fótons de alta energia (como a laser dissecador 2), esta tecnologia foi estendida para nano-manipulação. O sistema de imageamento óptico fornece um controle preciso para visualizar e manipular alvos celulares sub 3. Ao mesmo tempo, graças à calibração precisa da potência do laser emitido, instrumentos ópticos de realizar qualquer manipulação da amostra mole ou invasiva, com reprodutibilidade precedentes.
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Protocolo
1. Setup Optical
O sistema óptico inteiro foi anteriormente descrito 15. Resumidamente, o sistema de pinças ópticas baseia-se numa onda contínua itérbio (CW), fibra de laser que opera a 1064 nm (IPG Laser GmbH). Um modulador de luz espacial (SLM) (LCOS-GSP, modelo X10468-07 - Hamamatsu) varia a fase do feixe de laser de entrada de IR para controlar a posição do foco pontual aprisionamento no prato de cultura por hologramas gerados por computador. As livremente disponíveis Blue-pinças de software (link da web na mesa do equipamento) hologramas gerados projetada no modulador de luz espacial. O interferômetro para medidas de espectr....
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Resultados
A célula gera forças de tração sobre o substrato por suas adesões focais. Força gerada pelos elementos do citoesqueleto estão em equilíbrio com a força contrária do substrato de cultura. Após a lesão do laser de neurites induzido, alguns dos cabos do citoesqueleto tensos são rompidas e sua tensão equilibrada é libertado porque a força contrária do substrato de adesão é eliminada. A tensão libertado é parcialmente distribuído nas adesões focais não afectadas, e o cordão ligado à membrana celular, realizada em uma armadil.......
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Discussão
Apresentamos neste trabalho um método quantitativo para comparar a adesão neurite ao substrato da cultura, através da realização de medidas de espectroscopia de força simultânea durante a laser lesão celular induzida. A libertação da tensão medida está relacionada com o grau de adesão das células ao substrato: as células com maior número de adesões focais devem libertar menos tensão. Medição da libertação da tensão em termos de piconewtons fornece uma grandeza física pelo qual se avalia a aderência axonal ao suporte de .......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Alberto Guiggiani para o desenvolvimento do sistema de controle em tempo real, Evelina Chieregatti e Hanako Tsushima para discussões criteriosas, Giacomo PRUZZO e Alessandro Parodi para o desenvolvimento de produtos eletrônicos personalizados e softwares, e Claudia Chiabrera e Marina Nanni para seu aconselhamento e assistência na preparação de cultura de células.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Microesferas de polímero, 4 μ m, COOH revestido | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | laser de fibra de onda contínua de itérbio (CW) operando a 1064 nm, com polarização linear |
| Modulador de luz espacial | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Software de pinças azuis | Grupo de óptica, Universidade de Glasgow | Software gratuito para download | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | Hamamatsu | Software | gratuito para downloadhttp://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 com placa C5460SPL 6041 | Fotodiodo de quatro quadrantes para medir x, y deslocamento da sonda presa |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Fotodiodo para medir z deslocamento da sonda presa |
| nano-pulso laser UV | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Laser UVA pulsado, comprimento de pulso 400 ps |
| Modulador óptico acústico | Olympus | MQ110-A3-UV, sílica | |
| Microscópio vertical | Andor | BX51 | Equipado com uma objetiva de imersão em água de 60, 0,9 NA, |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Dispositivo Peltier | Physic Instruments | QE1 aquecimento resistivo com aquecedor de canal duplo TC-344B controlador | |
| Estágio do microscópio: estágio micro+piezo National | Instruments | Três estágios lineares M-126. CG1 carregando um estágio de nanoposicionamento piezoelétrico de 3 eixos separado P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Adquirindo a posição x, y, z da sonda presa e enviando sinais de loop de feedback para o estágio do microscópio | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) | Sistema de loop de feedback em tempo real, para controlar a posição do estágio, desenvolvido em um desktop de PC dedicado |
Referências
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
- Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
- Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et ....
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Reimpressões e permissões
