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1. Expansão dos NPCs Humanos (Figura 1)
- Reviver o lote congelado de NPCs humanos a partir de cérebro fetal (Lonza, Walkersville, MD, EUA) e cultura deles em suspensão em frascos T-75 como neuroesferas (Figura 1A), em meio neurobasal contendo suplementos de proliferação, EGF (10 ng / ml) e FGF (10 ng / ml).
- Após 3 dias em cultura, as neuroesferas transferir para um tubo de 15 ml e centrifugar a 500 rpm durante 5 min.
- Descartar o sobrenadante deixando ~ 100 ul de gama média acima do pellet celular e transferir para um tubo Eppendorf. A pelota de 100 células mL é suficiente para dividir em dois T-75 frascos. Se menos, reduzir o número de garrafas que as células não conseguem proliferar neuroprogenitoras se dividir fina.
- Tritura-se o sedimento com 200 ul de ponta 50x, mantendo a ponta 200 ul contra o fundo do tubo. Divida a suspensão de células igualmente em duas partes e adicioná-los a 2 T-75 frascos (1-2 split), um para a continuidadeexpansão e outro para a diferenciação.
- Continuar a cultura das células neuroprogenitoras para expansão (primeiro balão), alterando o meio cada 4-5 dias, até que as neuroesferas atingir o seu tamanho original de 300-500 mM. Mude meio por centrifugação (500 rpm, 5 min), descarte o meio de idade e adicionar novo meio.
2. Diferenciação de NPCs Humano em uma Cultura Neuron-ricos (Figura 2)
- Para a diferenciação das células em cultura neuroprogenitoras rico neurónio, colocar uma única lamela para cada poço de uma placa de 24 poços e com revestimento de 100 ug / ml de poli-L-lisina através da adição de 500 uL em cada poço. Incubar os pratos durante 30 min a RT.
- Aspirar o poli-L-lisina solução e lave a placa com água estéril.
- Em seguida, revestir as cavidades da placa com 500 ul de 5 ug / ml de laminina rato e incubar durante 30 min. Após a incubação, lavar os poços com PBS.
- 4 dias após a splitting as células (passo 1.4), transferir os pequenos neuroesferas do frasco rotulado "para a diferenciação 'nos pratos revestidos, a uma densidade de ~ 500 neuroesferas por poço de uma placa de 24 poços.
- Depois de 6 horas, quando as neuroesferas anexar ao prato, remover o meio de proliferação e diferenciação adicionar meio consistindo em meio neurobasal, suplemento B27, o NGF (20 ng / ml), BDNF (10 ng / ml), a DBC (100 mM), e ácido retinóico (2 uM).
3. Coloração de imunofluorescência diferenciadas NPCs (Figura 3)
- Após cultura de células neuroprogenitoras em meio a diferenciação neuronal durante duas semanas, uma cultura rica em neurônio é obtida. Lavar os neurónios uma vez com PBS e, em seguida, corrigi-los em paraformaldeído a 4% durante 30 min. Uma vez fixo, lavar as células três vezes com PBS.
- Incubar as células com tampão de permeabilização (5% de BSA e 0,2% de Triton X-100 em PBS) à temperatura ambiente durante 60 min.
- Incubar os pratos O / N a 4 ° C ind agitador com a seguinte combinação de anticorpos monoclonais e policlonais em 3% de BSA em PBS: NeuN (1:250) e sinapsina (1:250); acetilcolinesterase (1:500) e sinaptofisina (1:250); BDNF (1 : 500) e GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) e GFAP (1:1.000).
- Lavar as lamelas três vezes com PBS e depois incubar com anti-coelho-Cy3 e anticorpos secundários, anti-ratinho FITC no escuro à TA durante 90 min. A seguir à incubação, as lamelas lavar três vezes com PBS.
- Coloque 10 ml de meio de montagem sobre uma lâmina de vidro, tirar a lamela da placa de cultura com uma pinça, e colocá-lo de cabeça para baixo no meio de montagem. Delicadamente, limpe qualquer meio de montagem excesso e selar as bordas com unha polonês.
- Examine os neurônios imunomarcadas em um microscópio de fluorescência.
4. Captura Laser Microdissecção de neurônios (Figura 4)
- Diferenciar NPCs em uma cultura rica em neurônios em PEN slides membranas revestidos com poli-L-lisina e laminina rato seguindo os procedimentos descritos para a Figura 2.
- Executar todas as etapas subseqüentes em condições RNase.
- Mancha as culturas usando HistoGene Stain (Arcturus) para visualizar as células.
- Encontrar as áreas de populações neuronais puros desprovidos de astrócitos, utilizando a imagem de mapa de estrada de todo o slide com o sistema Veritas LCM. Marque os neurônios usando as ferramentas de desenho.
- Realizar captura a laser destas áreas utilizando precisão e automação controlado por computador num processo de dois passos. Primeiro, IR (infravermelho) é acionado em vários pontos com um ajuste de potência do laser de 70 mW e um pulso de 2.500 ms para obter a membrana anexar ao cap. Em seguida, a área marcada é extirpado usando uma ferramenta de corte UV para um nível baixo nível de 10 mV.
- Combinação destes processos de captura selectivamente as zonas marcadas a partir da membrana para PEN CapSure LCM macro cápsulas. Quando a tampa é levantada, a membrana com o neurons adere à tampa.
- Isolar o RNA total a partir de amostras de LCM, utilizando um kit de isolamento de RNA PicoPure (Arcturus) e trata-se com ADNase.
- Amplificar o ARN isolado utilizando o kit de amplificação de RNA RiboAMP seguindo as instruções do kit.
- Realizar a análise em tempo real de RT-PCR utilizando sondas TaqMan para detectar neurofilamento humano de cadeia pesada (hNFHc).
Abreviações:
AD, doença de Alzheimer, o BDNF, o factor neurotrófico derivado do cérebro, CREB, cíclico proteína de ligação de elemento de resposta a AMP; DBC, dibutiril AMP cíclico; EGF, factor de crescimento epidérmico; FGF, factor de crescimento de fibroblastos; GFAP, proteína ácida fibrilar glial, LCM, laser capturar microdissection; NGF, fator de crescimento do nervo; NPC, neuroprogenitoras célula; PEN, naftalato de polietileno.