Summary
İnsan neuroprogenitor hücreleri (NPC) çoğalan koşullar altında genişletilmiştir. NPC nörotrofinlerin bir kombinasyonunun mevcudiyetinde nöron zengin kültürler içine ayırt edildi. Nöronal belirteçler immunofloresan boyama ile tespit edilmiştir. Nöron saf bir popülasyonu izole etmek için, NPC PEN membran slaytlar üzerinde farklılaştırılmış ve lazer yakalama mikrodiseksiyon uygulandı.
Abstract
Insan fetal beyninden izole Neuroprogenitor hücreleri (NPC) epidermal büyüme faktörü (EGF) ve hücrelerin bol kaynağı sağlamak için fibroblast büyüme faktörü (FGF) mevcudiyetinde çoğalma koşulları altında genişletilmiştir. NPC sinir büyüme faktörü (NGF), yeni bir kombinasyonunun mevcudiyetinde ayırt edildi, beyin-türevi nörotrofik faktör (BDNF), dibutiril cAMP (DBC) ve poli-L-lisin ve laminin ile kaplanmış fare yemekler retinoik asit nöron elde edilmesi için zengin kültürleri. NPC da nörotrofinlerin olmaması, DBC ve retinoik asit ve astrosit zengin kültürler elde etmek için, siliar nörotropik faktör (CNTF) mevcudiyetinde ayırt edildi. Farklılaştırılmış NPC Neun, synapsin, asetilkolinesteraz, sinaptofizin ve GAP43 dahil nöronal belirteçlerin bir panel için immunofloresan boyama ile karakterize edildi. Glial fibriller asidik protein (GFAP) ve STAT3, astrosit belirteçleri, farklı NPC'nin 10-15% olarak tespit edilmiştir. Kolaylaştırmakhücre tipi özel moleküler karakterizasyonu, lazer yakalama mikrodiseksiyon polietilen naftalat (PEN) membran slaytlar üzerinde kültürlenmiş nöronlar izole etmek için yapıldı. Bu çalışmada açıklanan yöntemler nörodejenerasyonun moleküler mekanizması anlayışımızı ilerletmek için değerli bir araç sağlar.
Introduction
Yaşam boyu nöron yan karıncıkların subventricular bölgesinde ve yetişkin memeli beyin 1 kıvrımlarının subgranular tabakasında meydana geldiği bilinmektedir. Neuroprogenitor hücreler (NPC) bu bölgelerde kaynaklanan nöronları, astrositlerde ve oligodendrositlerin 2 farklılaşabildiği multipotent hücrelerdir. NPC nedeniyle, Parkinson hastalığı, amiyotrofik lateral skleroz, felç ve Alzheimer hastalığı (AD) 3 de dahil olmak üzere, çeşitli nörodejeneratif bozukluğu olan hastalarda nakledilen için potansiyel ilgi yarattı. NPC'ler ile çalışmalar genellikle bu nakli açısına odaklanmış ama Nörodejenerasyonun mekanizmasını belirlemek için hücre kültürü modeli olarak NPC-türetilmiş nöronların potansiyeli tam olmamıştır. Değillerse olarak daha önceki çalışmalarda, genellikle, her bir deney için izole edilmesi gerekli kemirgen beyin dokularından izole post-mitotik nöronlar kullandıkkendini yenileyen. SH-SY5Y ve SK-N-MC hücreleri de dahil olmak üzere insan nöroblastoma hücre çizgileri genişletilebilir de, primer nöron özelliklerine sahip değildir. Birden çok geçişleri için genişletilebilir ve primer nöron 4,5 olan özelliklere sahip bir hücre popülasyonu elde etmek için farklı olabilir, çünkü insan NPC, diğer taraftan, iki avantajlar sunmaktadır. Bu çalışmada, insan fetal beyninden izole edilmiş ticari olarak temin edilebilen NPC'lerden tutarlı bir nöron zengin nüfus elde etmek için yeni bir farklılaşma protokol açıklar. Bu kültürler, glial hücrelerin küçük bir yüzde içeren olduğundan, biz moleküler karakterizasyonu için nöron saf popülasyonu izole etmek için ek yöntemler gerekir. Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) bir doku bölümünden hücrelerinin homojen bir popülasyon seçici gen ekspresyon analizi 6 yakalanabilir hangi bir yeni bir tekniktir. Beyin nöronları, glia ve diğer hücre ty oluşan heterojen bir dokudurpes. LCM nörona özgü gen ekspresyonunu tespit etmek için kullanılmıştır 7-10 analiz eder. Daha önce, özellikle hipokampal nöronlar 11 azalma siklik AMP yanıt elemanı bağlayıcı proteinin ekspresyonunu (CREB) ve BDNF göstermek için AD (Tg2576) fare beyin kesitlerden hipokampal nöronlar LCM gerçekleştirdik. Bu çalışmada, biz PEN membran slaytlar kültüre nöronların izolasyonu için insan NPC genişlemesi, nöronal farklılaşma, nöronal belirteçler için immunofluorescent boyama ve LCM için prosedürler açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. İnsan NPC genişleme (Şekil 1)
- Dondurulmuş fetal beyin (Lonza, Walkersville, MD, USA) ve proliferasyon takviyeleri, EGF (10 ng / ml) ihtiva eden bir ortam içinde neurobasal neurospheres (Şekil 1A) gibi T-75 şişelerinde süspansiyon kültür bunları insan NPC'nin stok ve canlandırmak FGF (10 ng / ml).
- Kültür içinde 3 gün sonra, 5 dakika boyunca 500 rpm'de bir 15 ml tüp ve santrifüj neurospheres aktarın.
- Hücre peleti ~ 100 | il yukarıda orta geride bırakarak Süpernatant atılır ve bir Eppendorf tüpüne aktarılır. A 100 ul hücre peleti 2 T-75 şişelerinde bölmek yeterlidir. Neuroprogenitor hücreler ince bölerseniz çoğalırlar başarısız olarak daha az, şişelerin sayısını azaltın.
- Tüpün alt karşı 200 ul ucu tutarken bir 200 ul 50x ucu ile pelet Karışım. Iki eşit parçaya bölün ve hücre süspansiyonu 2 T-75 şişelerinde (1-2 split), sürekli için birine eklemenizfarklılaşması için genişleme ve başka.
- Neurospheres 300-500 mikron orijinal boyutuna ulaşana kadar her 4-5 gün orta değiştirerek genişleme (ilk şişe) için neuroprogenitor hücrelerin kültürü devam etmektedir. (500 rpm, 5 dk) santrifüj ile orta değiştirin, eski orta atmak ve yeni orta ekleyin.
2. Bir Nöron-zengin Kültür içine İnsan NPC Farklılaşma (Şekil 2)
- Bir nöron zengin kültürüne neuroprogenitor hücrelerin farklılaşması, her bir kuyuya 500 ul ilave edilerek poli-L-lisin, 100 ug / ml, 24-çukurlu plaka ve ceket her oyuğuna tek bir lamel yerleştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika için yemekler inkübe edin.
- Poli-L-lisin solüsyonu aspire ve steril su ile plaka yıkayın.
- Daha sonra, kat 5 ug / ml fare laminin 500 ul plakanın kuyuları ve 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, PBS ile kuyu yıkayın.
- 4 gün sonra, splittiHücreleri (adım 1.4) ng, 24 çukurlu levha başına ~ 500 neurospheres yoğunluğunda kaplı kaplar içine 'ayrımı için,' etiketlenmiş şişenin küçük neurospheres aktarın.
- Neurospheres çanak iliştirdiğinizde 6 saat sonra, yayılması orta kaldırmak ve neurobasal orta oluşan farklılaşma orta ekleyin, B27 takviyesi, NGF (20 ng / ml), BDNF (10 ng / ml), DBC (100 mM), ve retinoik asit (2 uM).
3. Farklılaştırılmış NPC İmmünofloresan boyanması (Şekil 3)
- Iki hafta içinde nöronal farklılaşma ortam içinde neuroprogenitor hücrelerinin kültürü takiben, nöron zengin bir kültür elde edilir. Bir kere PBS içinde nöronları yıkayın ve daha sonra 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehid içinde tespit edin. Sabit sonra, hücreler PBS ile üç kez yıkayın.
- 60 dakika boyunca oda sıcaklığında permeabilizasyon tamponu (% 5 BSA ve PBS içinde% 0.2 Triton X-100) ile hücrelerin inkübe edin.
- 4 ° C i de yemekler O / N inkübena aşağıdaki PBS içinde% 3 BSA içinde poliklonal ve monoklonal antikorların bir kombinasyonu ile çalkalama: neun (1:250) ve synapsin (1:250) asetil kolinesteraz (1:500) ve sinaptofizin (1:250), BDNF (1 : 500) ve GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) ve GFAP (1:1000).
- PBS ile lamelleri üç kez yıkayın ve daha sonra 90 dakika süre ile karanlıkta, oda sıcaklığında anti-tavşan-Cy3 ve anti-fare-FITC sekonder antikor ile inkübe edin. İnkübasyondan sonra, PBS ile lamelleri üç kez yıkayın.
- Forseps ile kültürü çanak lamel dışarı almak ve montaj ortamına ters yerleştirin, bir cam slayt üzerine montaj orta 10 ul yerleştirin. Yavaşça, herhangi bir aşırı montaj orta siliyorum ve oje ile kenarları mühür.
- Bir floresan mikroskobunda immunosteyn nöronlar inceleyin.
4. Nöronlar Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon (Şekil 4)
- PEN membran slayt üzerinde nöron-zengin kültürüne NPCleri ayırtŞekil 2 için tarif edilen yöntemler kullanılarak poli-L-lisin ve laminin ile kaplanmış fare var.
- RNAse içermeyen koşullar altında tüm sonraki basamakları gerçekleştirir.
- Hücreleri görselleştirmek için HistoGene Leke (Arcturus) kullanarak kültürleri Leke.
- Veritas LCM sistemi ile tüm slayt yol haritası görüntü kullanılarak astrositlerde yoksun saf nöronal nüfus alanları bulabilirsiniz. Çizim araçlarını kullanarak nöronlar işaretleyin.
- Iki aşamalı bir işlemde, bilgisayar kontrollü hassas ve otomasyon kullanılarak bu alanların lazer yakalama yapın. İlk olarak, IR (Kızıl Ötesi) membran kapağa bağlamak için 70 mW ve 2500 mikro-saniye bir darbenin bir lazer güç ayarına çok yerlerde ateşlenir. Daha sonra, işaretli alanı 10 mV düşük seviyede UV ayarda bir kesme aleti ile eksize edilir.
- Bu süreçlerin kombinasyonu seçici CapSure LCM makro kapaklar üzerine PEN zardan İşaretli alanların yakalar. Kapak kaldırıldığında olduğunda, N ile zareurons kapağa bağlıdır.
- Bir PicoPure RNA izolasyon kiti (Arcturus) kullanarak LCM örneklerinden total RNA izole ve DNase ile tedavi.
- Kiti talimatları izleyerek RiboAMP RNA amplifikasyon kiti kullanılarak izole RNA yükseltin.
- İnsan nörofilaman ağır zinciri (hNFHc) algılamak için TaqMan problar kullanılarak gerçek zamanlı RT-PCR analizi yapın.
Kısaltmalar:
AD, Alzheimer hastalığı, BDNF, beyin türevli nörotrofik faktör, CREB, siklik AMP yanıt elemanı bağlayıcı protein; DBC, dibutiril siklik AMP, EGF, epidermal büyüme faktörü; FGF, fibroblast büyüme faktörü; GFAP, gliyal fibriler asidik protein, LCM, lazer mikrodiseksiyon yakalama, NGF, sinir büyüme faktörü, NPC, neuroprogenitor hücre, PEN, polietilen naftalat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
NPC genişleme (Şekil 1)
Neurospheres tritürasyon ile tek bir hücre süspansiyonu için ayrılmış zaman, pipet ucu süspansiyon yukarı ve aşağı pipetle bir direnç, böylece tüpün alt dokunun gerekiyor. Öğütülmesinden sayısıdır bireyler ve bir mikroskop altında elde edilen hücre süspansiyonu incelenerek deneme yanılma ile karar verilmesi gereken arasında değişir. NPC yakın temas sırasında proliferasyon, bir daha hızlı olacaktır, çünkü bu hücre süspansiyonunun yeterli yoğunluğu sağlamak için çok önemlidir. NPC büyümek yoksa, hücre yoğunluğu şişe sayısını azaltarak artırılmalıdır. Biz kadar 10-15 geçişleri için neurospheres genişletmek mümkün olmuştur. İnsan NPC Böylece bol kaynağı insan fetal doku kullanımının azaltılması, oluşturulabilir. NPC ve nöronların sürekli temini için, bu daha sonra 3-4 geçişleri için, bunları başlangıç olarak genişletmek için tercih edilir ve, NPC yarısı neurospheres olarak açılabilir ve diğer yarısı devam eden deneyler için ayırt edilebilir. Seçenek olarak ise, aynı zamanda NPC stoklarının geniş kaynağı oluşturmak için hücre çizgilerinin durumunda olduğu gibi, sıvı nitrojen içerisinde donduruldu daha geçişleri için, genişletilmiş ve gerektiğinde canlandırabilir. Bu NPC farklı kısımlarının türetilen nöron ile deneyler gerçekleştirmek için de arzu edilir.
NPC Nöronal Farklılaşma (Şekil 2)
NPC multipotent hücreler ve kültür koşullarına bağlı olarak nöronları, astrosit veya oligodendrosit olarak ayırt edilebilir. Bizim farklılaşma protokolü kaplanmış yemekler (Şekil 2A) 4-günlük neurospheres tohumlama çıkıyor. Biz, bu ayırt nöronlar yayılmış ve nöron yoğun bir ağ oluşturacak şekilde neurospheres yeterli yoğunluğa tohum için gerekli olduğu görülmektedir. Görüntü sonra 1 (Şekil 2B) ve 4 gün (Şektohumlama ure 2C) gösterilmiştir. % 80-90 ve% 10-15 nöronlar astrositler elde Neuron zengin kültürler, NGF, BDNF, DBC ve iki hafta içinde (Şekil 2D) için retinoik asidin bir kombinasyonunun mevcudiyetinde NPC farklılaşmasının sonra elde edildi. Bildiğimiz kadarıyla, nöronal farklılaşması için bu çalışmada açıklanan protokol diğerleri tarafından daha önce bildirilmemiştir. Düşük yoğunluklu alanlarda, NPC astrositlerde (Şekil 2E) ayrışmıştır. Bir astrosit-zengin kültürünü elde etmek için, NPC CNTF (10 ng / ml) varlığında ve NGF, BDNF, DBC ve retinoik asit yokluğunda kültürlenebilir. Bu durumda, nöron-astrosit bileşim deney nesnesine bağlı olarak, farklılaşması sırasında manipüle edilebilir.
Farklılaştırılmış Nöronlar Karakterizasyonu (Şekil 3)
Ayrıca bu farklılaşmış NPCleri karakterize etmek için, biz w nöronal belirteçler için çift bağışıklık boyamasım yapılanCy3 (kırmızı) ve sırasıyla FITC (yeşil) bağlı tavşan ve fare ikincil antikorlar izledi ith maruz poliklonal ve monoklonal antikorlar,. Aşağıdaki nöronal belirteçler tespit edilmiştir: Şekil 3A:. Neun ve synapsin Şekil 3B:. Asetil kolinesteraz (Açe) ve sinaptofizin Şekil 3C: BDNF ve GAP43. Bu nedenle, farklı NPC birincil nöronların özelliklere sahiptir. Buna ek olarak, astrosit belirteçler STAT3 ve GFAP küçük bir hücre nüfusu (Şekil 3A) olarak tespit edilmiştir. Bu nedenle ek yöntemler nörona özgü gen ekspresyon analizi için ihtiyaç vardır.
Nöronlar Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon (LCM) (Şekil 4)
Bu sıkıca kaplı kaplar bağlı olduğu için LCM bir kültür kabı, başarısız nöronlarla LCM bizim ilk denemeleri hücrelerin izolasyonu için de kullanılabilir, ancak. Bu sorunu aşmak için, NPC ô farklılaşmışn poli-L-lisin ve laminin ile kaplanmış fare PEN membran ekler ile kayar. Lam, bir 100 mm hücre kültür çanağı (Şekil 4A) içine yerleştirilmiştir. PEN zar slayt ve LCM kapaklar düzenlemeleri Şekil 4B'de gösterilmektedir. Kültürler hücreleri (Şekil 4C) görselleştirmek için Histogen leke (Arcturus) ile boyandı. Kayıcı Arcturus Veritas enstrüman mikroskop yerleştirilmiştir. Çekilecek nöronlar çizim araçları (Şekil 4D) ile işaretlendi. CapSure HS Caps PEN zarı üzerine yerleştirildi. UV lazer kesim ve IR lazer yakalama bir arada kullanarak, işaretli bölgeler, kapağın üzerine toplanmıştır. Yakalanan nöronlar düşük de kapak (Şekil 4F) ve yüksek (Şekil 4F) büyütme gösterilir.
Şekil 1.İnsan NPC genişleme. A. NPC neurospheres gibi T75 şişeleri içinde süspansiyon içinde kültürlenmiştir. Neurospheres 300-500 um boyutuna ulaştığı zaman B., bunlar 15 ml tüplere aktarıldı ve 5 dakika boyunca 1000 RPM'de santrifüj işlemine tabi tutulmuştur. Süpernatan atılmış ve 200 ul ortam içindeki hücre topağı Eppendorf tüplerine aktarılır ve toz haline getirilmiştir. bölünmüş hazır D. Neurospheres gösterilmiştir. ufalandıktan sonra E. Broken neurospheres gösterilmiştir.
Şekil 2. İnsan NPC Farklılaşma. A. Neurospheres yeni neurospheres oluşturmak için dört gün için toz haline getirme ve kültüre tarafından kırıldı. B. dört günlük eski neurospheres poli-L-lisin ve laminin ile kaplanmış fare deney kabı içine ekilmiştir. C. differentiaNPC tion tohumlama sonra üç gün sonra, NGF, BDNF, DBC ve retinoik asit mevcudiyetinde gözlenmektedir. D. Nöron-zengin kültürü iki hafta sonra elde edildi. E. NPC düşük yoğunluklu bölgelerde astrositlerin ayrışmıştır. F. NPC CNTF (10 ng / ml) varlığında ve NGF, BDNF, DBC ve retinoik asit yokluğunda bir astrosit-zengin kültür ayrışmıştır.
Şekil 3,. Nöronal ve. NPC iki hafta içinde diferansiye insan NPC de astrosit belirteçler sabit ve poliklonal ve monoklonal antikorlar ile belirtilen hedefler için immunosteyn çift, Cy3 (kırmızı) ve sırasıyla FITC (yeşil) bağlı tavşan ve fare ikincil antikorlar maruz bırakılarak takip edildi. Aşağıdaki nöronal belirteçler tespit edildi: A. neun ve synapsin.B. Asetil kolinesteraz (AChE) ve sinaptofizin. C. BDNF ve GAP43. Buna ek olarak, aşağıdaki astrosit işaretleri tespit edilmiştir: D. STAT3 ve GFAP.
Şekil 4. Nöronların lazer yakalama mikrodisseksiyon. A. NPC poli L lizin ve fare laminin ile kaplanmış bir PEN zar slaytta ayırt edildi. Lam, bir 100 mm hücre kültür çanağı içine yerleştirilmiştir. B. Arcturus Veritas cihaz içinde PEN membran slayt ve LCM kapak düzenlemeleri gösterilmiştir. Kültürler hücreleri görselleştirmek için Histogen leke (Arcturus) ile boyandı. D. Çekilecek nöronlar çizim araçları ile işaretlenmiştir. Yakalanan nöronlar düşük ve kapak (E) ve yüksek (F) Magni gösterilirSınıflamasına. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, kendi kendini yenileyen insan neuroprogenitor hücrelerin farklılaşması ile nöron-zengin bir hücre kültürü modeli ve lazer yakalama mikro-kesim ile nöronların saf popülasyonu izole etmek için bir yöntem tarif eder. Biz NGF, BDNF, DBC ve NPC nöronal farklılaşma için retinoik asit bir arada kullandık. DBC CREB, nöron 12 arttıran bir transkripsiyon faktörü aktif hale getirmek için kullanılır. Retinoik asit, hücre döngüsü çıkışına neden ve glial nüfusu 13 azaltır. Bu çalışmada açıklanan yöntem, önceki raporun üzerinden 14 değişiklikler içeriyor. Biz daha önce tek bir hücre süspansiyonu neurospheres triturating ve sonra kaplı yemekleri onu tohumlama adımı kullanmıştı. Bu düşük yoğunluklu (Şekil 2E) bölgelerinde verimsiz nöronal farklılaşma yol açabilir. Şimdi differentia arasında temas sağlamak için dört günlük küçük neurospheres (Şekil 1B) tohumlama prosedürü girmiştikting nöronlar (Şekil 1C). Buna ek olarak, farklılaşma takviyesi (Stem Celi Technologies) 4-5 gün sonra tohumlama, B27 takviyesi (Invitrogen) ile değiştirilir. Geçerli yöntem sürekli% 80-90 nöronlar verir. Süreçlerinin geniş bir ağ ile bu nöronlar, 2-3 ay boyunca kültür içinde insan nöroblastoma hücre hatları farklılaşması kaynaklanan nöronal modeli üzerinde ayrı bir avantaj korunabilir. Neun, synapsin, asetilkolinesteraz, sinaptofizin ve GAP43 dahil olmak üzere birçok nöronal belirteçler için immün farklılaşmış NPC (Şekil 3) ile gözlendi. STAT3 ve GFAP, astrositler markerleri de küçük bir hücre popülasyonunda tespit edilmiştir. 2-5 uM retinoik asidin konsantrasyonunun arttırılmasıyla, astrosit nüfusun daha da azaltılabilir. Glial hücreler, büyüme faktörlerinin salgılanması ile nöronların canlı kalmasını sağlama Ancak, bu kültürler, uzun bir süre için muhafaza edilemez. Bu gözlemledik ki bu3-5 gün önce deneyler retinoik konsantrasyonunu arttırmak için istenmektedir.
Farklılaşmış nöronların heterojen doğası hücre-tipi-özgü gen ekspresyon profili belirlenmesi açısından sorunlar ortaya koymaktadır. Bu nedenle, kültürlenmiş nöronların LCM (Şekil 4) için gerekli koşulları optimize ettik. Onlar sıkıca bağlı olarak bu tekniği normal hücre kültürü yemekleri kültüre nöronlar ile zorluklar sunulan çünkü mevcut çalışmada, PEN membran ekler ve yapılan LCM ile slaytlar üzerinde NPC farklılaşmış. LCM amaçları imünohistokimyasal analizi ile karşılanabilir, ancak LCM, RNA seviyesinde sinyal yükseltmek katlı analiz yeteneği ve doğru bir miktarının dahil olmak üzere birçok avantaj sunmaktadır. Mikroarray ile birleştirildiğinde, LCM seçilen hücre tipinde 15 binlerce gen ekspresyon analizi sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ilan etmek hiçbir çıkar çatışması.
Acknowledgments
Bu çalışma (SP) Gaziler İdaresi Liyakat İnceleme hibe (NEUD-004-07F) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neuroprogenitor cells (NPCs) | Lonza | PT-2599 | |
| Neurocult NS-A human basal medium | Stem cell technology | 5750 | |
| Neurocult NS-A Proliferation supplement | Stem cell technology | 5753 | |
| Neurocult NS-A Differentiation supplement | Stem cell technology | 5754 | |
| B-27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Human epidermal growth factor | Stem cell technology | 2633 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F0291 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Cell signaling | 3897S | |
| Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma | D-0627 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P-5899 | |
| Mouse laminin | Sigma | L-2020 | |
| Retinoic acid | Sigma | R-2625 | |
| STAT3 antibody | Cell signaling | 9132 | |
| GFAP antibody | Cell signaling | 3670 | |
| GAP43 antibody | Transduction laboratories | 612262 | |
| BDNF antibody | Millipore | AB1534SP | |
| Acetyl cholinesterase antibody | Santz cruz | Sc-11409 | |
| Synaptophysin antibody | Abcam | ab18008-50 | |
| NeuN antibody | Chemicon | MAB377 | |
| Synapsin antibody | Novus | NB300-104 | |
| Anti mouse FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
| Research Laboratories | |||
| Anti Rabbit Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
| Research Laboratories | |||
| BSA | Sigma | A1653 | |
| Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
| Paraformaldehye | Fisher | 4042 | |
| Coverslip (Big circle cover slip) | Fisherbrand | 12-545-102 | |
| Mounting medium (Prolong Gold) | Invitrogen | P36930 | |
| Pen membrane | Applied biosystems | LCM0521 | |
| Histogene LCM frozen section staining kit | Applied biosystems | KIT0401 | |
| RiboAmp RNA Amplification kit | Applied biosystems | KIT0201 | |
| Picopure RNA Isolation kit | Applied biosystems | KIT0202 | |
| CapsureMacro LCM caps | Applied biosystems | LCM0211 |
References
- Doetsch, F. The glial identity of neural stem cells. Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).
- Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. Neural stem cells: an overview. Circ. Res. 92, 598-608 (2003).
- Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review. J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).
- Breier, J. M., et al. Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science. Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).
- Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection. J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).
- Robles, Y., et al. Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning. Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).
- Su, J. M., et al. Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues. Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).
- Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. Downregulation of CREB expression in Alzheimer's brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons. Mol. Neurodegener. 6, 60 (2011).
- Dworkin, S., Mantamadiotis, T.
- Trujillo, C. A., et al. Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics. Cytometry A. 75, 38-53 (2009).
- Pugazhenthi, S., et al. Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells. J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).
- Kamme, F., et al. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity. J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).
