Tripsina Digest protocolo para analisar a vascularização da retina de um rato modelo

Resumo

A tripsina é uma compilação dos métodos mais utilizados para analisar a vasculatura retiniana. Este manuscrito descreve o método em detalhes, incluindo alterações importantes para otimizar a técnica e remover o tecido não-vascular, preservando a arquitetura geral dos vasos.

Resumo

Tripsina digest é o método padrão de ouro para analisar a vasculatura retiniana ^1-5. Ela permite a visualização de toda a rede de vasos complexas tridimensionais retina sanguíneos e capilares, criando um bidimensional plana de montagem dos canais vasculares interligados após digestão dos componentes não-vasculares da retina. Isto permite estudar várias alterações patológicas vasculares, tais como a degeneração capilar, microaneurismas, e anormal endoteliais rácios pericyte. No entanto, o método é tecnicamente difícil, especialmente em ratos, que se tenham tornado o modelo animal mais amplamente disponíveis para estudar a retina por causa da facilidade de manipulações genéticas ^6,7. No olho do rato, é particularmente difícil de remover completamente os componentes não-vasculares, mantendo a arquitectura geral dos vasos sanguíneos da retina. Até o momento, há uma escassez de literatura que descreve a técnica de digestão de tripsina em detalhe in o mouse. Este manuscrito fornece uma metodologia detalhada passo-a-passo da tripsina digest no rato retina, além de fornecer dicas sobre solução de problemas etapas difíceis.

Introdução

A visualização da vascularização da retina é uma abordagem extremamente importante para dissecar os mecanismos de várias doenças oculares, tais como retinopatia diabética. Ele permite avaliar as anomalias vasculares, incluindo primeiros microaneurismas, degeneração e perda capilar, pericyte ^8,9. Até à data, tem havido várias técnicas desenvolvidas para analisar a vascularização da retina. Perfusão de vários corantes foi utilizada para realçar os vasos, mas todos têm partilhado limitações semelhantes. Injeção raramente destaca toda a vascularização da retina, a menos dado a uma pressão elevada, o que corre o risco de se romper e danificar os vasos ^1. Imunocoloração do endotélio vascular com fluorophore marcado G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 conjugado; I21413; Invitrogen; 1:100) e monta plano de retina pode-se destacar a arquitetura geral dos vasos, mas sem visualização detalhada dos capilares, membranas basais e pericitos . Foi notada pelosFriedenwald que os navios podem ser destacados pela coloração plana montagens de retina com ácido periódico de Schiff (PAS) ou hematoxilina e eosina (H & E) coloração ^10. No entanto, a coloração não foi específico para os vasos e destacada do tecido não-vascular, bem como, o que torna difícil a diferenciação dos vasos. Na década de 1960, Cogan e Kuwabara desenvolveu a técnica digest tripsina que tornou mais fácil a visualização da vascularização da retina através da digestão dos componentes não-vasculares da retina ^1. Desde essa altura, a tripsina digest tornou-se o método padrão de ouro na análise da vasculatura da retina ^2-5. No entanto, é importante notar que outras técnicas alternativas para isolar a vasculatura tenham sido descritas. A utilização de lise osmótica foi usado para isolar a vasculatura e permitir estudos bioquímicos do tecido ^11,12, mas o procedimento não tem sido utilizada como um método primário para estudo anatómicos. O método de impressão de tecidos tem sidousado para isolar grandes segmentos da microvasculatura e permite a possibilidade de estudar a arquitectura electrotonic da vasculatura ^13. Em teoria, esta técnica também pode ser usada para estudar alterações anatómicas, como a qualidade dos vasos é elevado. No entanto, só é capaz de isolar segmentos de toda a rede vascular. Embora estes métodos não podem substituir a tripsina digest, é importante notar que eles têm diferentes vantagens e desvantagens e são complementares a este respeito.

O método digest tripsina é tecnicamente desafiador e é difícil de executar de forma consistente ^6,7. Além disso, tem sido observado que a tripsina digest é especialmente difícil num modelo de ratinho, especialmente se se deseja preservar a arquitectura global vascular da retina ^6,7. Os desafios incluem (1) sobre-digestão da retina que provoca a perda de ambas a vasculatura, bem como do tecido não-vascular, (2) sub-digestão, requerendoextensa dissecção mecânica que poderia levar a danos do leito do navio, (3) separação deficiente do tecido não vascular a partir da vasculatura levando a coloração não específica. Vários manuscritos têm destacado estes desafios, mas nenhum deles forneceu um protocolo detalhado e consistente para superá-los ^14,15. Este manuscrito irá introduzir uma metodologia passo a passo detalhando a técnica para realizar a digestão da tripsina no rato e rato retinas com dicas específicas sobre o tratamento das etapas particularmente difíceis. Um esquema geral é mostrado na Figura 1.

Protocolo

1. Preparação da retina

1. Enuclear o olho mouse. Usando um lado, abrir as pálpebras para que o olho é visível. Com a outra mão, usando uma pinça curva (curvas virada para cima), aplicar pressão sobre aspectos superior e inferior da órbita até que se projeta globo. Com cuidado, feche fórceps no aspecto posterior do olho e levante em um movimento contínuo para enuclear o olho.
2. Corrigir olhos com 10% de formalina tamponada neutra por pelo menos 24 horas.
3. Lugar olho em solução PBS em uma pequena placa de Petri.
4. Dissecar retina cuidadosamente sob um microscópio, tendo o cuidado de evitar induzir grandes lágrimas. Faça um corte inicial na córnea com uma tesoura de dissecção. Em seguida, mantendo a área de corte com uma pinça reta, use uma tesoura para cortar ao longo da fronteira da córnea e esclera remoção da córnea. Usando pinça fina curvas e retas, cuidadosamente descascar a esclera e coróide longe da retina para o nervo óptico. Esta etapa exige paciência,libertando rapidamente a retina pode levar às lágrimas. Remover a lente e qualquer excesso de detritos da íris e a retina ^16.

2. A água lava

1. Ponto retina num prato de 24 cavidades e cobrir com água (aproximadamente 500 mL, filtrado com pelo menos um filtro de 45 mm).
2. Troque a água a cada 30 min-1 hora, pelo menos 4-5 vezes.
3. Deixe durante a noite em água com agitação suave à temperatura ambiente.

Nota: Os passos de lavagem são muito importantes, pois ajudam a separar as camadas da retina neural a partir dos vasos sanguíneos.

3. Tripsina Digest

1. Remover a água e retina incubar numa solução de 3% de tripsina (Difco 1:250) em tampão Tris 0,1 M (pH 7,8) a 37 ° C com agitação suave para não. Tripsina digestão é completado quando o tecido começa a exibir sinais de desintegração (aproximadamente 1,5 horas).
   Nota: Evite agitação rápidapois isso pode danificar a vasculatura.
   
2. Cuidadosamente, pipetar a tripsina em separado bem usando um microscópio para evitar tocar a retina. Este excesso de tripsina pode ser usado mais tarde, quando manipular os navios sob o microscópio, no passo 4.3.

4. Separar a vasculatura

1. Adicionar água filtrada para a retina. Em seguida, tentar descolar a membrana limitante interna com uma pinça, usando uma tesoura, se necessário. Agite com agitação suave durante 5 min. Cuidadosamente, pipeta a água sob o microscópio para evitar danificar a retina.
2. Repita lavagens com água (por 5 min cada) para ajudar a libertar a rede de vasos do tecido da retina aderente. Lavagens de água são completados quando existe pouca ou nenhuma detritos remanescentes na água após a lavagem.
3. Manipulações cuidadosas sob um microscópio de dissecação são agora necessários para liberar ainda mais a rede de vasos. Estes são várias técnicas úteis, que podem ser usados ​​em sequência ou individually para atingir o resultado desejado com base na preferência do técnico:
   1. Usando uma pipeta de 200 mL, pipetar cuidadosamente água para cima e para baixo ao lado de vasos, soprando água em vasos, causando agitação suave.
   2. Usando uma pipeta de 200 mL, pipeta a tripsina cima e para baixo para ajudar paredes casaco da pipeta. Então, com cuidado pipeta toda a rede de vasos cima e para baixo uma vez para ajudar a quebrar tecido não vascular.
      Nota: centragem da ponta da pipeta no nervo óptico, em vez de as bordas da rede vascular pode também prevenir a vascularização de furar a ponta.
      
   3. Levante cuidadosamente vasculatura com uma pinça fina de água para desalojar os componentes não-vasculares.
   4. Se as etapas acima não funcionarem, adicione tripsina para a retina para ajudar a quebrar o tecido, e incubar a 37 ° C por alguns minutos. Em seguida, retire de tripsina e repita os passos de 4,1-4,3.

Nota: Certifique-se de casaco de todos os instrumentos que entrarão em contato com os vasos em tripsina (por exemplo, a ponta da pipeta, fórceps). Isto irá ajudar a evitar a adesão da vasculatura para o equipamento.

5. Visualizando a vasculatura

1. Colocar uma gota de água sobre uma lâmina de limpeza. Usando uma pipeta ou uma pinça 200 ul, transferir os vasos digeridos na água. Verifique se o plano de montagem vascular é desdobrada. A tensão superficial da água ajuda a desdobrar a rede vascular agora diáfano. Se o tecido não se desdobra, adicione mais água e agitar suavemente a lâmina para facilitar desdobramento.
2. Retire o excesso de água muito lentamente por pipetagem ou usando uma toalha de papel.
3. Deixar as lâminas para secar completamente.
4. Mancha lâminas via protocolo apropriado tanto com PAS / Hematoxilina ou H & E mancha.
   Nota: PAS / hematoxilina é útil para a identificação da parede do vaso e núcleos celulares, H & E é útil para o demonstration de RBC bem.
   
5. Desidratar e montar (Permount meio de montagem).

Resultados

O produto final de um processo bem sucedido é um plano de montagem de toda a rede da vasculatura da retina do rato, com a arquitectura mantida, coradas quer com PAS / hematoxilina ou H & E, tal como mostrado nas Figuras 2-4. Limpar a diferenciação das células endoteliais e pericitos pode ser visto como mostrado na Figura 3. Na retina, os núcleos das células endoteliais são ovais ou alongadas e ficar inteiramente dentro da parede do vaso. Pericyte núcleos são pequenos, esférico, manc...

Discussão

Tripsina digest é um método padrão para avaliar a vasculatura da retina. Infelizmente, não é tecnicamente difícil e pode resultar numa elevada taxa de perda de amostra se não for realizado correctamente. Além disso, o procedimento é especialmente difícil, em ratos, o que pode limitar a aplicação desta técnica, os modelos animais genéticos usados ​​de doenças oculares. Este documento fornece orientação sobre como realizar o procedimento de forma eficaz e consistente no rato olhos.

Existem vár...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
REAGENTS
10% de formalina tamponada neutra	Fischer Scientific	SF100-4
Tripsina (1:250)	Amresco	0458-50G	Faça 3% de tripsina em 0.1 M Tris
TRIZMA base	Sigma	T1503-1KG	Crie 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 ° C)
TRIZMA	Sigma	T3253-500G
Garrafa de vácuo estéril	Millipore	SCGPS05RE	Criar água
EQUIPMENT
Microscópio			Qualquer microscópio que permita uma boa visualização da retina é adequado. (10x é suficiente com distância de trabalho de 24 mm)
Tesoura reta	Fine Science Tools	15024-10	Aresta de corte: 8 mm; Diâmetro da ponta: 0,2 mm; Pinça reta de 10 cm
(Inox)	Dumont #5	11252-20	Ponta de biologia; 0,05 x 0,02 mm; 11 cm
de forceptos curvos (Dumostar)	Dumont #7	11297-10	Ponta de biologia; 0,07 x 0,04 mm;
Incubadora de agitador metabólico Dubnoff	Agitador	de BDG59442	de precisão opcional
Prato de 24 poços	Falcon	353047
Lâminas de microscópio	VWR	82027-132