Caracterização de Respostas Inflamatórias Durante Colonização Intranasal com Streptococcus pneumoniae

Resumo

A colonização da nasofaringe murina com Streptococcus pneumoniae e a subsequente extração de células aderentes ou recrutadas é descrita. Esta técnica envolve a lavagem da nasofaringe e a coleta do fluido através das nares e é adaptável para várias leituras, incluindo quantificação celular diferencial e análise da expressão mRNA in situ.

Resumo

A colonização nasofaríngea por Streptococcus pneumoniae é um pré-requisito para a invasão aos pulmões ou corrente sanguínea¹. Este organismo é capaz de colonizar a superfície mucosa da nasofaringe, onde pode residir, multiplicar e eventualmente superar as defesas hospedeiras para invadir outros tecidos do hospedeiro. O estabelecimento de uma infecção no trato respiratório normalmente inferior resulta em pneumonia. Alternativamente, as bactérias podem se disseminar na corrente sanguínea causando bacteremia, que está associada a altas taxas de mortalidade², ou então levar diretamente ao desenvolvimento de meningite pneumocócica. Entender a cinética e as respostas imunológicas à colonização nasofaríngea é um aspecto importante dos modelos de infecção por S. pneumoniae.

Nosso modelo de camundongos de colonização intranasal é adaptado dos modelos humanos³ e tem sido usado por vários grupos de pesquisa no estudo de respostas hospedeiras-patógenos na nasofaringe^4-7. Na primeira parte do modelo, utilizamos um isolado clínico de S. pneumoniae para estabelecer uma colonização bacteriana auto-limitante que seja semelhante aos eventos de transporte em adultos humanos. O procedimento aqui detalhado envolve a preparação de um inóculo bacteriano, seguido da criação de um evento de colonização através da entrega do inóculo através de uma via intranasal de administração. Macrófagos residentes são o tipo de célula predominante na nasofaringe durante o estado estável. Normalmente, há poucos linfócitos presentes em camundongos não infectados⁸, no entanto a colonização mucosa levará a inflamações de baixo a alto grau (dependendo da virulência das espécies bacterianas e da cepa) que resultarão em uma resposta imune e o subsequente recrutamento de células imunes hospedeiras. Essas células podem ser isoladas por um lavado do conteúdo traqueal através das nares, e correlacionadas com a densidade das bactérias de colonização para entender melhor a cinética da infecção.

Protocolo

Antes de começar: todas as etapas são feitas em um Gabinete de Segurança Biológica Nível 2 (BSL2) de Biohazard ( BSC) a menos que seja indicado de outra forma. Certifique-se de que obteve a aprovação biohazard apropriada para o uso de patógenos bacterianos infecciosos de acordo com as diretrizes institucionais antes do início dos experimentos. Além disso, certifique-se de que você tenha todos os materiais e reagentes necessários para realizar o procedimento preparado com antecedência. Os camundongos usados nesses experimentos incluíram camundongos C57BL/6 femininos dos Laboratórios Jackson, Charles River ou Taconic e tinham de 10 a 14 semanas de idade (embora não tenhamos encontrado diferenças significativas de gênero na cinética do despejo ou infecção da colonização nasal). Todos os camundongos usados nesses experimentos foram criados e mantidos em condições específicas de livre de patógenos, e estavam livres de vírus comuns, (LCMV, MNV, MPV, reovírus ECTV, e outras) bactérias(por exemplo, H. pylori) e parasitas(por exemplo, pinworm, ectoparasitas) por testes de amostras fecais, bem como avaliação anatômica frequente de ratos sentinelas cohoused dentro de suas salas de instalação. Ao realizar esses experimentos, recomendamos o uso de ratos de controle não inferiores a 10-12 semanas de idade e não mais do que 6 meses de idade. Camundongos mais jovens ou mais velhos do que essa faixa etária são mais suscetíveis à maior duração do transporte nasofaríngeo e ao aumento da probabilidade de disseminação da infecção. O fundo do rato é outra consideração importante que pode impactar os resultados de um experimento de colonização, pois vários grupos demonstraram que camundongos de diferentes origens genéticas têm diferentes suscetibilidades à cepa S. pneumoniae D39 (sorotipo 2)^9,10. S. pneumoniae não é um patógeno murina que ocorre naturalmente e seu único reservatório natural é a nasofaringe humana. A transmissão ocorre por meio de gotículas respiratórias, e como os camundongos não produzem secreções respiratórias, camundongos individuais não podem transmitir a bactéria para outros camundongos, portanto não há preocupação com a transmissão de camundongos para camundongos¹¹. Para uma visão geral visual dos procedimentos descritos neste manuscrito, consulte a Figura 1.

1. Preparação da Cultura S. pneumoniae

1. Inocular 5 ml de ágar de soja trippática para o crescimento da suspensão de Streptococcus pneumoniae.
2. Cultura em condições estáticas a 37 °C em 5% de CO₂ até que o inóculo bacteriano atinja o crescimento da fase de tronco com uma densidade líquida correspondente de 10⁸ UFC/ml, conforme determinado por um odômetro definido para 600 nm. A leitura exata correspondente a esta UFC difere dependendo da cepa bacteriana selecionada específica; para a maioria das cepas de S. pneumoniae isso corresponde a uma faixa de_{OD 600} de 0,45-0,55. Normalmente, as cepas de s. pneumoniae na cultura líquida crescerão para essa densidade dentro de 1,5-2,5 horas sob as condições recomendadas, sem necessidade de subcultura. A cultura não deve ser permitida a superação (além de uma leitura de OD de 0,75) pois isso representa o ponto em que as bactérias não estão mais em crescimento de fase de registro e estão sofrendo extensas autólises.
3. Cada rato será inoculado com aproximadamente 10⁷ bactérias. Portanto, para cada 9 ratos a serem colonizados, pipeta 1 ml de inóculo em um tubo Eppendorf e gire a 15.000 x g por 1 min. Uma pelota esbranquiçada deve ser visível. Remova o supernasciente, tomando cuidado para não perturbar a pelota e resuspensar as bactérias em 100 μl de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS), aumentando assim a concentração para 10⁹ UFC/ml. Nesta fase, as bactérias devem permanecer viáveis, mas não se replicarão prontamente.
4. Se usar várias alíquotas, combine-se em um tubo para controlar pequenas variações inter-amostrais na densidade bacteriana.
5. Mantenha as bactérias no gelo até ficarem prontas para a inoculação, por um máximo de 1 hora.
6. Para obter uma contagem bacteriana exata, realize séries de diluição serial em termos de tronco começando com um inóculo bacteriano puro. Diluir serialmente 10 vezes, adicionando 10 μl de 90 μl de PBS estéril.
7. Aplauda 3 gotas de 10 μl de amostras de diluições 10^-5 - 10^-9, mais um controle de contaminação somente PBS, em seções separadamente rotuladas de ágar de soja tripptic (TSA) suplementado com 5% de sangue de ovelha(Figura 2). Certifique-se de que as pontas da pipeta sejam alteradas para cada etapa diluindo de uma maior concentração de UFC para uma menor concentração de UFC para evitar o excesso de bactérias e a crescente variabilidade dos resultados. Placas de ágar de sangue humano (HBA) também podem ser usadas em vez de TSA. Uma vez que muitas cepas de S. pneumoniae são resistentes à neomicina (de 5-20 μg/ml), este antibiótico também pode ser adicionado ao meio de ágar de escolha durante a fase de preparação da placa. Isso facilita a enumeração, pois elimina bactérias não ressarentes. A suscetibilidade antibiótico de cada cepa deve ser testada com antecedência para determinar a concentração ideal de antibiótico para usar em cada cepa bacteriana.
8. Deixe secar por 15-30 min descobertos, depois cubra as placas e coloque de cabeça para baixo na incubadora bacteriana definida a 37 °C e 5% de CO₂. Cresça colônias bacterianas na placa por 24 horas.
9. Determine o número de unidades formadoras de colônias e sua concentração correspondente. Com base nas determinações do valor OD_600, a concentração deve estar dentro da faixa de 1-4 x 10⁹ COLÔNIAS DE CFU/ml. S. pneumoniae devem aparecer como pequenas colônias circulares de cor amarelada-bege, com uma pequena depressão no centro dando-lhes uma aparência semelhante a donut(Figura 3).

2. Colonização Intranasal Murine

1. Contenha os ratos colocando-os em um aparelho de contenção de camundongos (um tubo Falcon modificado de 50 ml com a ponta cortada para criar uma abertura) protegendo-os pela base de seu corpo com o polegar para que seus narizes saiam da extremidade afilada do aparelho de contenção(Figura 4). O uso deste aparelho permite a imobilização da cabeça do camundongo e a segregação de seus nares de forma a minimizar o movimento, bem como impedir tentativas do animal de mastigar a ponta pipeta, permitindo a entrega completa do inóculo. Alternativamente, os camundongos podem ser imobilizados através de arranhões no pescoço e contenção manual. Não recomendamos anestesia dos animais antes da inoculação intranasal. Administrar o inóculo aos animais sob anestesia resulta em parte do inóculo se espalhando para os pulmões^12,13.
2. Usando uma pipeta P10 ou P20, inocular cada rato depositando 10 μl da cultura preparada, distribuindo-o uniformemente entre ambas as nares (permita que o inóculo escorresse no nariz, pulsando a inoculação gradualmente, levando tempo para os ratos inalarem inóculo). Para conseguir a entrega completa do inóculo, pausa a administração a qualquer momento o mouse começa a mover seu nariz excessivamente. Todo o inóculo não pode ser injetado nas nares, pois os ratos podem expulsar alguns pelo nariz durante a expiração; no entanto, como a quantidade expelida tende a ser minúscula, e o inóculo contém uma quantidade extremamente alta de bactérias, isso não afeta significativamente a carga bacteriana colonizadora. Além disso, a área de superfície disponível para colonização na mucosa nasofaríngea é limitada e, consequentemente, nós e outros descobrimos que a dose recomendada de^{10 7} é suficiente para obter níveis consistentes de bactérias em todos os camundongos, resultando em variabilidade mínima em quantidades iniciais de bactérias colonizadoras^14,15 .
3. Pese camundongos se utilizar indicadores de peso como parte do seu monitoramento de ponto final. Monitore camundongos a cada 12-24 horas para sintomas clínicos, incluindo letargia, pele de babados e perda de peso. Os camundongos normalmente não apresentarão sintomas de doença até 3-5 dias após a colonização, e estes serão precedidos pela perda de peso, que pode em média cerca de 5% do peso corporal total por dia. À medida que os camundongos ficam cada vez mais doentes, eles assumirão posturas curvadas e mostrarão diminuição da atividade e diminuição da capacidade de resposta à estimulação, incluindo o manuseio. Nesta fase, a doença é tipicamente indicativa de sepse e/ou pneumonia e provavelmente será terminal, embora os camundongos possam ser tratados com 1 ml de soro fisiológico subcutâneo diariamente para melhorar os resultados. Os camundongos sobreviventes devem começar a apresentar melhora após o 7º dia pós-colonização, como evidenciado pela estabilização do peso seguida do ganho de peso, embora diferentes cepas de S. pneumoniae possam induzir a doença mais rapidamente e resultar em progressão de sintomas clínicos ao longo de uma linha de tempo diferente. Consulte a Figura 5 para obter um resultado representativo de peso rastreado em camundongos colonizados com a cepa P1547.

3. Coleção de Amostras de Lavage Nasal

Antes do início: prepare agulhas canuladas usando seringas de 1 ml tampadas com agulhas chanfradas de 3/8 G. Corte 2,5 cm de tubos de polietileno PE20 com diâmetro interno de 0,38 mm, garantindo que cada extremidade tenha uma ponta chanfrada. Utilizando fórceps, deslize um pedaço de 2,5 cm de comprimento da tubulação de polietileno PE20 (diâmetro interno 0,38 mm) na ponta da agulha, evitando perfurar o lado do tubo. Agulhas canuladas podem ser mantidas em 70% de etanol até que seja necessário.

1. Eutanize ratos experimentais. Como a luxação cervical pode potencialmente danificar a traqueia, este método de eutanásia deve ser evitado. Nosso método preferido é a anestesia isoflurane seguida de exsanguinação, no entanto, garantir que você siga as diretrizes institucionais ao selecionar o modo de eutanásia.
2. Utilizando 70% de etanol aquoso, esterilize a pele superoanterior do animal, particularmente o pescoço, tomando cuidado para evitar que o etanol acesse as nares.
3. Faça um único corte longitudinal ao longo da linha média do pescoço do animal, e dois cortes horizontais em cada extremidade, criando uma abertura para vislumbrar a traqueia.
4. Retire cuidadosamente a pele para ambos os lados, revelando tecido do pescoço por baixo.
5. Traqueia deve ser visível, cercada por músculos longitudinais de ambos os lados. Corte-os cuidadosamente para fornecer uma visão clara da própria traqueia, tomando cuidado para não cortar a vasculatura circundante.
6. Se a vasculatura foi cortada e o sangue estiver presente, antes do processo, permitir que o sangramento pare e, em seguida, limpe a área várias vezes, dispensando PBS estéril e usando gaze estéril para absorver suavemente o excesso de umidade na área.
7. Uma vez que a traqueia esteja devidamente exposta, faça um corte transversal e semilunar na traqueia a meio caminho de cima(Figura 6).
8. Elabore 1.000 μl de PBS esterilizado em agulha canladada previamente preparada.
9. Insira cânula na traqueia em direção ao nariz, mantendo a borda chanfrada apontando para baixo para facilitar a inserção(Figura 7). Uma vez que a agulha esteja no lugar, gire-a 180°, e teste suavemente para cima até sentir resistência à luz.
10. Coloque Eppendorf designado para coleta de amostras logo abaixo do nariz do mouse.
11. Teste a colocação correta da agulha dispensando uma quantidade mínima (~20 μl) de fluido de lavagem PBS - a gota de fluido deve se formar ao redor das nares do mouse; se for esse o caso, proceda à etapa 3.13).
12. Se o teste pbs emergir diretamente para fora da boca do animal, puxar a cânula para trás, e reposicionar-se novamente sondando suavemente para a frente até que uma resistência muito leve seja sentida - tome cuidado para não empurrar a cânula muito longe desta resistência, como você vai movê-la além do paladar nasal e através da cavidade oral.
13. Dispensar rapidamente o conteúdo da agulha para ajudar a deslocar e coletar a quantidade máxima de células - o conteúdo deve fluir através das nares do mouse e para o tubo de coleta. Coloque a amostra imediatamente no gelo.
14. Para coletar amostras para análise de RNA, repita as etapas 3.8-3.13) usando uma agulha canulada contendo 500 μl de tampão de RNA no mesmo mouse. Isso permitirá a coleta de amostra de liseto das populações de células remanescentes, em grande parte composta do epitélio mucosal nasofaríngeo, uma vez que as células não adesedentes deveriam ter sido removidas após a lavagem inicial da PBS. Observe que o tampão de rna lysis irá desnudir o epitélio e destruir o tecido circundante, por isso deve-se tomar cuidado para evitar o contato com órgãos como os pulmões, se a retenção desses tecidos for desejada. Uma vez coletada, coloque a amostra no tampão de rna lise diretamente no gelo seco para congelar. Uma vez no tampão de lise, as amostras podem ser armazenadas de acordo com as instruções do fabricante, e são estáveis normalmente a -70 °C por vários meses.

4. Determinação da Carga Bacteriana na Nasofaringa

1. Quantitate bactérias preparando uma série de diluição serial para cada amostra de lavage nasal murina. Em geral, espera-se que a carga bacteriana seja entre 0-10⁴ UFC, portanto, realizar três diluições seriais de 10 vezes. Adicione 10 μl da amostra de lavage nasal (100 UFC/ml) ao primeiro tubo a uma concentração de 10^-1 CFU/ml. Vórtice completamente.
2. Divida a placa bacteriológica em quadrantes e rotule os quadrantes cada um com um membro da série de diluição (10^-10-3 CFU/ml). Aplauda 3 gotas de 10 μl amostras das 3 diluições e a amostra pura em placas de ágar de soja tripptica suplementadas com 5% de sangue de ovelha, como na Figura 2.
3. Deixe secar por 15-30 minutos descobertos, depois cubra as placas e coloque de cabeça para baixo na incubadora bacteriana com condições ideais para o crescimento bacteriano (tipicamente 37 °C e 5% de CO₂).
4. Cresça colônias bacterianas na placa por 18-24 horas.
5. Determine o número de bactérias colonizadoras, com a média das colônias formadas em placa para cada diluição(Figura 3). A Figura 8 demonstra densidade bacteriana em diferentes momentos, conforme determinado pela cultura de lavages nasais, em camundongos colonizados com 3 cepas diferentes de S. pneumoniae por até 21 dias.

5. Preparação de Amostras para Cicímetro de Fluxo

Antes de começar: Prepare a mistura de anticorpos. Para quantificação de populações leucócitos, recomendamos a seguinte mistura nas diluições especificadas: PE-Ly6G (clone 1A8, 1 μg/ml), FITC-Ly6C (clone AL-21,1 μg/ml), eFluor 450-CD45 (clone 30-F11, 2,67 μg/ml), APC-F4/80 (clone PM8 RUO, 0,67 μg/ml), PerCP-Cy5.5-CD11c (clone N418 RUO, 0,5 μg/ml), PE-Cy7-CD11b (clone M1/70, 0,33 μg/ml), Alexa Fluor 700-CD3 (clone 1782, 4 μg/ml), eFluor 605NC-CD4 (clone GK1.5, 6,67 μg/ml). Observe que esta mistura é de 2x de concentração (ver passo 5.5). Todos os anticorpos devem ser diluídos no tampão de lavagem dos FACs (soro de bezerro fetal de 0,5%, 2mM EDTA, 0,1% azida de sódio na PBS) que também deve ser preparado antecipadamente. Em uma mistura de anticorpos de controle combinados de isótipo, idealmente do mesmo fornecedor dos anticorpos rotulados e nas mesmas concentrações que os anticorpos específicos, devem ser preparados. As amostras tratadas com os anticorpos de controle do isótipo funcionarão como o controle negativo. Qualquer fluorescência observada nas amostras tratadas com os anticorpos de controle do isótipo deve ser considerada de fundo.

1. Prechill uma centrífuga capaz de girar tubos Eppendorf de 1,5 ml a 4 °C.
2. Centrífuga amostras de lavage nasal a 2.000 x g por 10 min a 4 °C. Pipeta cuidadosamente para fora supernante e reserva. Nota: devido à pequena quantidade de células dentro da nasofaringe, a pelota celular não será visível a menos que haja contaminação indesejada de glóbulos vermelhos, que será vermelho brilhante. Se isso for visto, a amostra deve ser descartada.
3. Amostra de resuspend em 50 μl de Fc? Anticorpo RIIb/CD16-2 (2.4G2) (que liga receptores Fc e reduz a ligação de anticorpos não específicos) em FACs Wash Buffer a uma concentração de 4 μg/ml.
4. Incubar amostras no gelo por 30 minutos.
5. Adicione 50 μl de mistura de anticorpos fluorescentes concentrados de 2x pré-preparados à amostra. Reserve uma amostra representativa de cada grupo experimental para atuar como um controle isótipo. Adicione a mistura de anticorpos isótipo a esta amostra em vez de mistura de manchas.
6. Incubar amostra no gelo por 1 hora.
7. Centrífuga amostras a 2.000 x g para 10 min a 4 °C. Descarte supernaspe e resuspend em 200 μl de PBS.
8. Repita o passo 5.7.
9. Após a segunda lavagem, as amostras centrífugas novamente a 2.000 x g por 10 min a 4 °C.
10. Resuspend em PBS (se executar amostra imediatamente) ou 2% paraformaldeído (se executar amostras de 1-3 dias após a coloração).
11. Ao realizar a citometria de fluxo, colete a quantidade máxima de eventos por amostra ou até que toda a amostra tenha sido aspirada. Em camundongos jovens e não infectados, saudáveis, isso será de apenas 1.000-2.000 eventos totais; Durante um evento de colonização bacteriana, esse número pode aumentar mais de 2 a 5 vezes o status da doença em animais e fatores como idade e fundo genético. A Figura 9 mostra resultados representativos de citometria de fluxo coletados de um citômetro de fluxo Becton Dickenson LSRII de 3 lasers usando uma dispersão dianteira de 450 e dispersão lateral de 300, embora recomendemos a otimização de parâmetros para o citómetro de fluxo específico que você pretende usar antes da coleta da amostra. Nota: se uma amostra contiver mesmo vestígios de contaminação sanguínea, o total de eventos coletados será significativamente maior do que o esperado e a amostra deve ser descontada da análise.

6. Análise quantitativa de PCR (qPCR) das Lavages Nasal

1. O degelo das células lístidas a partir da temperatura ambiente do passo 3.14.
2. Siga o protocolo recomendado fornecido com a extração preferida de RNA de escolha.
3. Após concluir o procedimento de extração de RNA como instruído, quantifique a quantidade de RNA usando um método baseado em espectrofotômetro ou eletroforese(Figura 10). Nós rotineiramente obtemos entre 975 e 3.250 ng total de RNA por amostra com uma razão de 260/280 nm de >1,7 ou um número de integridade de RNA (RIN) em torno de 8,1±0,13.
4. Transcreva cDNA usando a Transcriptase Reversa M-MULV de acordo com o protocolo do fabricante com 1.000 ng de RNA (máximo de 13 μl).
5. Diluir as amostras de CDNA resultantes 8x, e alíquota igualmente em 4 tubos separados para armazenamento a longo prazo a -20 ou -80 °C.
6. Para medir a expressão genética por qPCR, prepare 25 μl amostras de reações em triplicado no gelo ou bloco frio contendo: 12,5 μl de 2x qPCR master mix do kit qPCR de sua escolha, 0,25 μl de corante de referência, 2 μl de cDNA diluído (etapa 7.5), 1 μl de primers mistos para a frente e reverso (final de 400 nM), 9,25 μl de água livre RNAse-DNAse. Este protocolo é uma adaptação dos métodos publicados anteriormente¹⁶.
7. Em geral, descobrimos que uma amplificação qPCR de duas etapas ( 95 °C para 10 min seguido por até 40 ciclos x [95 °C x 15 seg, 60 °C x 1 min]) é eficaz(Figura 11a); no entanto, cada par de primer deve ser otimizado. As curvas de dissociação (derretimento) devem ser realizadas após a amplificação para garantir que não ocorreu nenhuma amplificação inespecífica. amplificação (Figura 11b)
8. Executamos rotineiramente curvas padrão para cada gene analisado, bem como um calibrador padrão (derivado de homogeneato de pulmão ou baço) para cada placa de 96 poços analisada. Os valores relativos da transcrição são obtidos pela primeira normalização dos valores do limiar de ciclo bruto (TC) pelo corante de referência e transformando os valores resultantes através da respectiva curva padrão. Essas quantidades relativas são posteriormente normalizadas para o calibrador padrão e um gene de limpeza, conforme aplicável.

Resultados

A Figura 1 representa uma visão geral que resume os principais passos do protocolo. As figuras 2-3 fornecem visualização da metodologia microbiológica inerente aos protocolos aqui descritos. A Figura 4 representa o posicionamento adequado de um rato para realizar uma colonização intranasal, enquanto a Figura 5 retrata tipicamente mudanças no peso de camundongos colonizados com cepa de S. pneumoniae P1547. As figuras 6-7 represen...

Discussão

Neste estudo, foram apresentados métodos detalhados para a colonização intranasal de camundongos utilizando uma cepa de streptococcus pneumoniae e o subsequente isolamento e caracterização das células imunes recrutadas para nasofaringe em resposta à bactéria. Demonstramos como um inóculo bacteriano pode ser cultivado em mídia rica em nutrientes e usado para estabelecer um evento de colonização em camundongos, que é inicialmente restrito à nasofaringe. Em seguida, mostramos como os tipos de células imunes que são...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anti-Mouse Ly6C FITC	BD Pharmingen	553104
Anti-Mouse Ly6G PE	BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450	eBioscience	48-0453-82
Anti-Mouse F4 / 80 Antígeno APC	eBioscience	17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7	eBioscience	25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC eBioscience		93-0041-42
Tubo de Polietileno Intramédico - PE20	Becton Dickinson	427406
BD Seringa de 1 ml	Becton Dickinson	309659
BD 26 G 3/8 Bisel Intradérmico	Becton Dickinson	305110
Tampão RLT Lise Buffer	Qiagen	79216
Ágar Soja Tríptica Difco	Becton Dickinson	236950
Sangue de Ovelha Desfibrinado	PML Microbiológicos	A0404
RNAqueous-Micro Kit	Ambion	AM1931
M-MuLV Transcriptase	ReversaNew England Biolabs	M0253L
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6001