Method Article

Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes

DOI:

10.3791/50521

⸱

July 23rd, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The College of Technology and Innovation, Center for Infectious Disease and Vaccinology, The Biodesign Institute, Arizona State University

In This Article

Summary

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Plantas oferecer um novo sistema para a produção de proteínas farmacêuticas, em escala comercial, que é mais escalável e de custo eficaz e segura que paradigmas expressão corrente. Neste estudo, apresentamos uma abordagem simples e conveniente, mas escalável para introduzir genes alvo contendo Agrobacterium Em plantas para a expressão transiente da proteína.

Abstract

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Cultura de células de mamífero é a plataforma principal para a produção comercial de vacinas humanas e proteínas terapêuticas. No entanto, ele não pode atender à crescente demanda mundial por produtos farmacêuticos, devido à sua escalabilidade limitada e de alto custo. As plantas têm demonstrado ser uma das plataformas de produção farmacêuticos alternativos mais promissores que são robustas, adaptar, de baixo custo e segura. O recente desenvolvimento de vectores baseados em vírus, permitiu a expressão transiente rápida e de alto nível de proteínas recombinantes em plantas. Para optimizar ainda mais a utilidade do sistema de expressão transitória, que demonstram uma metodologia simples, eficiente e de adaptar a introdução do gene alvo contendo de Agrobacterium para o tecido vegetal neste estudo. Os nossos resultados indicam que tanto a seringa agroinfiltration com vácuo e métodos têm como resultado a introdução eficiente de Agrobacterium em folhas e robusta de produção de duas proteínas fluorescentes; GFP e DsRed. Além disso,que demonstram as vantagens únicas oferecidas pelos dois métodos. Infiltração seringa é simples e não precisa de equipamentos caros. Ele também permite a flexibilidade, quer se infiltrar toda a licença com um gene alvo, ou a introdução de genes de múltiplos alvos em uma folha. Assim, ele pode ser usado para a expressão à escala laboratorial de proteínas recombinantes, bem como para a comparação de diferentes proteínas ou vectores para a cinética de produção ou expressão. A simplicidade de infiltração seringa também sugere a sua utilidade no ensino médio e educação superior para o tema da biotecnologia. Em contraste, a infiltração por vácuo é mais robusto e pode ser dimensionada e para produção comercial de proteínas farmacêuticas. Também apresenta a vantagem de ser capaz de agroinfiltrate espécies de plantas que não são passíveis de seringa infiltração tais como a alface e Arabidopsis. Em geral, a combinação de uma seringa e agroinfiltration vácuo fornece investigadores e formadores de uma simples, eficiente e robustametodologia para a expressão da proteína transiente. Vai facilitar muito o desenvolvimento de proteínas farmacêuticas e promover a educação científica.

Introduction

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Desde os anos 1970, as plantas foram explorados como alternativas a culturas de células de mamíferos, insectos, bactérias e para a produção comercial de proteínas recombinantes e uma proteína terapêutica. Sistemas à base de plantas para a expressão de biofármacos têm se mostrado promissor nos últimos anos, vários novos tratamentos para doenças, como a doença de Gaucher 2 e 3 da gripe aviária H5N1, têm demonstrado sucesso em ensaios clínicos. O desenvolvimento de mecanismos competentes para a expressão de proteínas recombinantes em plantas nas décadas desde os primeiros experimentos criou o potencial para sistemas à base de plantas par....

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Protocol

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1. O crescimento das plantas

  1. Lugar de 60 de turfa pelotas em uma bandeja de propagação. Adicionar 4 L de água da torneira e deixar a turfa pelotas de absorver a água por 2 horas.
  2. Adicionar 2 N. benthamiana sementes em cada pastilha de turfa utilizando um semeador, cobrir a bandeja com uma cúpula de plástico transparente, e permitir que elas germinam num ° C, 84% de humidade ambiente de 25 com um ciclo de dia / noite de 16/8 horas (Figura 1A).
  3. Remover a cúpula de duas semanas após a sementeira, drenar a água da bandeja, e adicionar 2 L de fertilizante de Jack a uma concentração de 1,48 g / L (Figura 1B).....

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Results

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1. Expressão de proteínas fluorescentes por infiltração Seringa

Para demonstrar a eficácia da seringa infiltração de Agrobacterium para o tecido vegetal, testou-se a expressão das duas proteínas fluorescentes - GFP e DsRed - por dois vectores virais diferentes de plantas Desconstruído - geminiviral e MagnICON - em N. benthamiana. Para N. benthamiana folhas que foram completamente infiltrados com Agrobacteria geminiviral vectores contendo, a expressão da GFP f.......

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Discussion

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A crescente demanda por produtos farmacêuticos à base de proteínas em todo o mundo exigem novas plataformas de produção que são robustas, escaláveis ​​e de baixo custo e segura. As plantas têm demonstrado ser um dos sistemas de produção alternativos mais promissores para a produção de proteínas farmacêuticas. Em anos recentes, o desenvolvimento de vectores baseados em Desconstruído vírus permitiu a expressão transitória de proteínas em plantas, o que aumenta grandemente a velocidade e o rendimento dos sistemas de expres.......

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Disclosures

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Os autores não competindo interesses financeiros.

Acknowledgements

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Agradecemos R. Sun e outros estudantes do laboratório de Chen por sua contribuição para usina de geração de material. Agradecemos também a Dr. D. Green por seu apoio de pesquisa de graduação na Faculdade de Tecnologia e Inovação (CTI). Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo NIH concede U01 AI075549 e 1R21AI101329 para Q. Chen, e uma bolsa de SSE de CTI do Arizona State University para Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, e J. Stahnke são estudantes de graduação apoiados pela concessão SSE.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
GFP InvitrogenV353-20www.invitrogen.com Consulte a referência: Lico e Chen, et al 2008
DsRedClontech632152www.clontech.com Ver referência: Baird e Zacharias, et al 2000
MagnICON VectorIcon Geneticsn/awww.icongenetics.com Ver referência: giritch e Marillonnet, et al 2006
GeminiviralVector Author' s Labn/aVer referência: Chen e He, et al 2011
N. benthamianaAutor' s Labn/aherbalistics.com.au
Agrobacterium tumefaciens cepa gv3101Autor' s Labn/aVer referência: Lai e Chen 2012
LB Agar Carbenicillin-100, placasSigmaL0418www.sigmaaldrich.com
LB Agar Kanamycin-50, placasSigmaL0543www.sigmaaldrich.com
Sulfato de magnésio hidrato de hepaSigmaM2773-500 gwww.sigmaaldrich.com
Bacto-TriptonaFisher73049-73-7www.fishersci.com
Extrato de levedura Bacto Becton, Dickinson CO.REF 212750www.bd.com
Difco Caldo de NutrientesBecton, Dickinson CO.REF 234000www.bd.com
MES hidrato BufferSigmaM8250-1kgwww.sigmaaldrich.com
CarbenicilinaSigmaC1613-1MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank"> www.sigmaaldrich.com< / a >
canamicinaSigma70560-51-9www.sigmaaldrich.com< / a>
hidróxido de sódioSigma221465< a href = "http://www.sigmaaldrich.com/" target = "_blank ">www.sigmaaldrich.com< / a>
Jack ' s FertilizanteHummert InternationalJul-25www.hummert.com
Equipment
Vacuubrand MD4 Bomba de VácuoFisher13-878-113www.fishersci.com
Vacuum Air Válvula ReguladoraFisherNC9386590www.fishersci.com
Dessecador 12 1/8" com anel OFisher08-594-15Cwww.fishersci.com
3 L BanheiraRubber-Maidn/aRubbermaid Servn' Saver Bowl, 10-cup vai funcionar
prato/prateleira 230MLFisherNC9489269www.fishersci.com
Peat PelletHummert International14-2370-1www.hummert.com
Bandeja de Propagação Domehydrofarm132052www.hydroponics.net
Propagaiton Trayhydrofarm138758www.hydroponics.net
Virbo Semeadora ManualGro-Mor INCn/awww.gro-morent.com
Flora Cart 4 prateleirasHummert International65-6924-1www.hummert.com
15 ml Tubos de Cultura de Fundo RedondoSigmaCLS430172-500EAa href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">http://www.sigmaaldrich.com
EspectrofotômetroBio-Rad170-2525www.bio-rad.com
Espectrofotômetro CuvetesBio-Rad223-9950www.bio-rad.com
Tubos de MicrocentrífugaEUA Científico1415-2500www.usascientific.com
Centrífuga de bancadaBio-Rad166-0602EDUa href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com
Incubadora/AgitadorEppendorfExcella E25 www.eppendorf.com
Ultravioleta Modelo#: UVGL-25UVP95-0021-12www.uvp.com
<<<Luz

References

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  1. Chen, Q. Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities - Essays by Experts. Mou, B., Scorza, R. , Taylor & Francis. 86-126 (2011).
  2. Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).<....

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AgroinfiltrationTransient ExpressionRecombinant ProteinsSyringe InfiltrationVacuum InfiltrationPlant BiotechnologyGFP ExpressionDsRed ExpressionAgrobacterium CulturePlant Transformation

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