O In ovo Membrana corioalantóica (CAM) está enxertado com sarcoma de tecidos frescos derivadas de tumor, as suas suspensões de células individuais, e marcados com fluorescência de linhas de células de sarcoma estabelecidas permanentes e transientes. O modelo é usado para estudar enxerto (viabilidade, Ki67 índice de proliferação, necrose, infiltração) e host (infiltração de fibroblastos, neoformação vascular) comportamento.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Sarcoma é uma doença muito rara, que é de natureza heterogénea, toda a impedir o desenvolvimento de novas terapias. Pacientes com sarcoma são candidatos ideais para a medicina personalizada após estratificação, explicando o interesse atual no desenvolvimento de um modelo de xenotransplante reprodutível e de baixo custo para esta doença. A membrana corioalantóide garota é uma série imunodeficientes natural, capaz de sustentar os tecidos enxertados e células sem restrições específicas de cada espécie. Além disso, é facilmente acedido, manipulados e fotografada usando estereomicroscopia óptica e fluorescência. Histologia permite análise mais detalhada das interações celulares heterotípicos.
Este protocolo descreve em pormenor o enxerto in ovo da membrana corioalantóica com sarcoma derivados de tecidos frescos de tumor, as suas suspensões de células individuais, e marcados com fluorescência de linhas de células de sarcoma estabelecidas permanentes e transientes (Saos-2 e SW1353). O rato sobrevivência garotaes são de até 75%. O modelo é usado para estudar enxerto (viabilidade, Ki67 índice de proliferação, necrose, infiltração) e host (infiltração de fibroblastos, neoformação vascular) comportamento. Para localizada enxertia de suspensões de células individuais, de ECM de gel proporciona vantagens significativas em relação aos materiais de contenção inertes. O índice de proliferação Ki67 está relacionada com a distância entre as células da superfície da CAM e a duração da aplicação no CAM, este último determina um período de tempo para a adição de produtos terapêuticos.
Introdução
Sarcoma é um tumor raro do tecido conjuntivo com uma elevada mortalidade devido à resistência à terapia 1,2. O progresso na sobrevida do paciente é dificultada pela sua baixa incidência anual, sua ampla diversidade, eo fato de que as células do sarcoma são relatados para ser difícil de cultura in vitro 3,4.
A utilização de células de cultura para a avaliação pré-clínica terapêutica revelou que novas moléculas, aparentemente activos in vitro nem sempre reflectem os resultados na prática clínica. Além disso, as aberrações genoma reveladas por matrizes de expressão de genes nem sempre são correlacionad....
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Protocolo
Veja a Figura 1 para uma visão geral
Material tumoral
1. Obtenção e preparação de amostras de tumor
Para a utilização do material do paciente, é necessária a aprovação do Comité de Ética e consentimento informado tem de ser obtida a partir do paciente.
- Colheita de material representativo (mínimo de 1 cm 3), no momento da intervenção, ou de uma biópsia ou uma ressecção de um sarcoma. O próprio site da biópsia é definida usando dinâmico de contraste MRI.
- Colocar imediatamente o material num frasco estéril contendo meio DMEM suplementado c....
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Resultados
Avaliação da CAM
Enxertos de tumor se tornar aderente à CAM (Figura 2A). As suspensões de células únicas de material paciente frequentemente exibir uma seco, a placa ligeiramente levantada (Figura 2D). Após a excisão da CAM, marcado enrugamento da membrana ocorre (figuras 2E e 2F).
Para as linhas celulares comerciais da placa torna-se mais opaca com o tempo, indicando a proliferação de células. Linh.......
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Discussão
Momento da inoculação e da colheita
Temporizando no dia da inoculação foi realizada utilizando gel de SAOS2 em ECM (CAMs 36) e variou entre o dia de desenvolvimento embrionário 5 e 10.
Antes da incubação dia 9, o CAM não foi consistentemente grande o suficiente para suportar o gel ECM foi aplicado. Na colheita, as células tumorais, por vezes, tinha de ser recuperado do CAM mais profunda, e algumas amostras de gel ECM estavam mentindo solta no albúmen ou no CAM. Nos .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Células da linha celular SW1353 condrossarcoma foram gentilmente cedidas pelo Prof Dr. PCW Hogendoorn e Prof Dr. J. Bovée Universidade de Leiden, na Holanda. Agradecemos J. Mestach e G. Wagemans para uma excelente assistência técnica, e G. De Bruyne para o desenho profissional do panorama do nosso protocolo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de nucleofector de linha celular V | Amaxa | VCA-1003 | |
| solução de colagenase 2 (500 U / ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 | |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Solução Dnase | Sigma Aldrich | DN25 | |
| G418 | Invitrogen | 11811031 | |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| anticorpo monoclonal primário de camundongo Ki67 | Dako Dinamarca | MIB-1 | |
| Paraformaldeído | Fluka | D76240 | |
| PBS | Invitrogen | 20012019 | |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 | |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 | |
| Penicilina/estreptomicina | Invitrogen | 15140163 | |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 | |
| Solução de tripsina-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
| Marcação de células Vybrant DiI | Lifetechnologies | 22885 | |
| Contador de células automatizado Countess | Invitrogen | C10227 | |
| câmera digital colorida | Leica | DFC 340 FX | |
| Incubadora Digital de Ovos | Auto Elex Co | R-COM 50 | |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII | |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Dissociador Gentlemacs | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | |
| Gentlemacs Dissociator Manual do Usuário contendo h_tumor protocolo | Miltenyi Biotech | ||
| [header] | |||
| filme adesivo semipermeável (Suprasorb F) | Lohmann& Microscópio | 20468 | |
| Leica | M205 FA | ||
| Tissue-Tek Filme de lamínula automatizada | Sakura | 6400 | |
| ultraView Ventana | Medical Systems Inc | 760-500 | |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical | Systems Benchmark XT |
Referências
- Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution. Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).
- Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al.
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Reimpressões e permissões
