Metabólica Rotulagem de Leucina rico Repita Kinases 1 e 2 com Radioactive Fosfato

Resumo

Leucina repetição rica quinases 1 e 2 (e LRRK1 LRRK2) são proteínas de vários domínios que codificam tanto GTPase e domínios cinase e que são fosforiladas em células. Aqui, apresentamos um protocolo para rotular LRRK1 e LRRK2 em células com ³² P-ortofosfato, proporcionando assim um meio para medir seus níveis gerais de fosforilação celular.

Resumo

Leucina repetição rica quinases 1 e 2 (e LRRK1 LRRK2) são parálogos que partilham uma organização do domínio semelhante, incluindo um domínio de serina-treonina cinase, um complexo de Ras de proteínas de domínio (ROC), um C-terminal do domínio ROC (CR), e repetições de anquirina-como no N-terminal rica em leucina e. As funções celulares precisas de LRRK1 e LRRK2 ainda tem de ser esclarecida, no entanto LRRK1 tem sido implicada na sinalização do receptor de tirosina-quinase ^{de 1,2,} enquanto LRRK2 está implicada na patogénese da doença de Parkinson ^3,4. Neste relatório, apresentamos um protocolo para identificar as proteínas LRRK1 e LRRK2 em células com ³² P-ortofosfato, proporcionando assim um meio para medir os níveis globais de fosforilação destas duas proteínas nas células. Em resumo, proteínas marcadas com afinidade LRRK são expressos em células HEK293T, que estão expostos a meio contendo ³² P-ortofosfato. A ³² P-ortofosfato é assimilado pelas células depois de apenas algunshoras de incubação e todas as moléculas na célula contendo fosfatos são, assim, marcado radioactivamente. Através da etiqueta de afinidade (3xflag) as proteínas LRRK são isolados a partir de outros componentes celulares por imunoprecipitação. Os imunoprecipitados são então separados por meio de SDS-PAGE, transferido para membranas de PVDF e análise dos fosfatos incorporados é realizada por auto-radiografia ⁽³² sinal P) e de detecção de western (sinal de proteína) das proteínas sobre as manchas. O protocolo pode ser facilmente adaptado para monitorar a fosforilação de qualquer outra proteína que pode ser expresso em células e isolado por imunoprecipitação.

Introdução

Leucina rico repetição quinases 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) são parálogos vários domínios que partilham uma organização de domínio semelhante. Ambas as proteínas de codificar uma sequência de GTPase semelhante à família Ras de GTPases (Ras de proteínas complexas, ou ROC), bem como um C-terminal do domínio ROC (CR), de forma eficaz classificando ambas as proteínas para a família de proteínas ROCO ^5,6. N-terminal do domínio em tandem ROC-COR, ambas as proteínas codificar um domínio de repetição rica em leucina, bem como um domínio de anquirina semelhante, ao passo que apenas LRRK2 codifica um tatu adicional Domein ^6-8. C-terminal de ROC-COR, ambas as pr....

Protocolo

O presente protocolo utiliza radioativo ³² ortofosfato marcado com P de seguir fosforilação celular de LRRK2. É importante ter em mente que todas as operações com reagentes radioativos deve ser realizada através de medidas de protecção adequadas para minimizar a exposição da radiação radioativa para o operador e para o ambiente. Compostos contendo isótopos que emitem radiação ionizante pode ser prejudicial para a saúde humana e licenciamento rigoroso e regulamentos em um controle de nível institucional e nacional o seu uso. Os experimentos deste protocolo foram realizados após o treinamento no uso da radiação de fonte aberta na Katholieke Universiteit Leuv....

Resultados

A fim de comparar os níveis globais de fosforilação de LRRK1 e LRRK2 nas células, 3xflag marcado LRRK1 e LRRK2 foram expressos em células HEK293T ^15. As células foram cultivadas em placas de 6 poços e marcado com ³² P e analisados ​​como descrito acima no texto do protocolo. Figura 1 mostra os resultados representativos para a marcação metabólica das LRRK1 e LRRK2 em células HEK293T. Incorporação de fosfato radioactivo é observada tanto para LRRK1 e LRRK2. Após a quantificaçã.......

Discussão

Este documento fornece um protocolo básico para ensaio geral do nível de fosforilação LRRK1 e LRRK2 em linhagens de células usando marcação metabólica com ³² P-ortofosfato. A estratégia global é simples. Afinidade proteínas marcadas LRRK são expressos em células HEK293T, que são expostos a meio contendo ³² P-ortofosfato. A ³² P-ortofosfato é assimilada pelas células depois de apenas algumas horas de incubação e todas as moléculas na célula contendo fosfatos são, assim, marcado radioactiv.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Radionuclídeo de fósforo-32, 1 mCi, tampão dissódico fosfato em 1 ml de água	Perkin Elmer	NEX011001MC
Dulbecco’ s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), líquido (glicose alta)	Invitrogen	11971-025	Este meio não contém fosfatos
Anti Flag M2 affiinty gel	Sigma	A2220	Para um produto equivalente com gel de cor vermelha (útil para visualizar mais facilmente as contas), use cat. Nº F2426.
Filtro de borrão extra espesso	Bio-Rad	1703965
solução Ponceau S Sigma		P7170