Métodos para a realização Cruzes em Setaria viridis, Um novo sistema de modelo para as gramíneas

Resumo

Nós desenvolvemos uma metodologia para a realização de cruzes em Setaria viridis (S. viridis). O método envolve a poda da panícula antes de um tratamento com água quente para matar pólen viável. Cruzes são executadas seguindo um regime de crescimento bem controlada e tipicamente resulta na recuperação de 1 a 7, a polinização cruzada de sementes / s por panícula.

Resumo

Setaria viridis é um sistema modelo emergente para C ₄ gramíneas. Ela está intimamente relacionada com o estoque switchgrass alimentação bioenergia ea foxtail milho safra de grãos. Recentemente, o genoma 510 Mb de painço foxtail, S. Itálica, foi seqüenciado ^1,2 e uma seqüência do genoma 25x cobertura da convivência em relação S. viridis está em andamento. S. viridis tem uma série de características que o tornam um potencial excelente sistema genético modelo incluindo um tempo de geração rápido, pequena estatura, os requisitos de crescimento simples, prolífica produção de sementes ³ ​​e sistemas desenvolvidos para a transformação tanto transitória e estável ^4. Contudo, a genética de S. viridis é em grande parte inexplorado, em parte, devido à falta de métodos detalhados para a realização de cruzamentos. Até o momento, nenhum protocolo padrão foi adotado, que permitirá a rápida produção de sementes a partir de cruzamentos controlados.

As pressões de protocolotura orientada aqui é otimizado para a realização de cruzamentos genéticos em S. viridis, A10.1 adesão. Nós empregamos um tratamento térmico simples, com água morna para castração após a poda da panícula de reter 20-30 florzinhas e rotulagem de flores para eliminar as sementes resultantes de flores recém-desenvolvidos após a emasculação. Depois de testar uma série de tratamentos térmicos a temperaturas permissivas, e variando o tempo de imersão, nós estabelecemos a uma temperatura óptima e intervalo de tempo de 48 ° C durante 3-6 min. Ao utilizar este método, um mínimo de 15 cruzamentos pode ser realizada por um único operador por dia e uma média de 3-5 descendência por cruzamento aberto panícula pode ser recuperado. Portanto, uma média de 45-75 progenitura cruzamento aberto pode ser produzido por uma pessoa num dia. Implementação Broad desta técnica vai facilitar o desenvolvimento de populações de linhas puras recombinantes de S. viridis X S. viridis ou S. viridis X S. italica, mapeando as mutações através de massa seanálise gregant e criar mutantes de ordem superior para a análise genética.

Introdução

S. viridis é uma NADP-ME subtipo C ₄ grama intimamente relacionado com o estoque switchgrass alimentação bioenergia (NAD-ME subtipo), o foxtail milho safra de grãos, ea erva daninha agrícola guiné grama ^5. O genoma 510 Mb de forma cultivada de Setaria, S. italica, foi recentemente seqüenciado ^1,2 e uma seqüência do genoma 25x cobertura da relação de convivência, S. viridis, está em andamento (não publicado). S. viridis tem uma série de características que o tornam um potencial excelente sistema genético modelo incluindo um tempo de geração rápido, pequena estatura, os requisitos de crescimento simples e prolífica produção de sementes ^3. Importante, métodos têm sido recentemente desenvolvidos para a transformação tanto transiente e estável de S. viridis, que oferecem a oportunidade para a criação de plantas transgênicas ^4. No entanto, o principal entrave para o desenvolvimento de ferramentas genéticas para S. viridis é sua recalcitrance para cruzamento. Até à data, nenhum protocolo padrão foi publicado que irá permitir a rápida produção de sementes a partir de cruzamentos controlados.

Cruzamentos genéticos em S. italica são normalmente realizados por emasculação através da remoção das anteras das flores ^6,7,8 ou através de tratamento térmico de flores de genitores femininos ^9-11. Após esses tratamentos, anteras ou panículas de flores não tratados / pais masculinos são suavemente desgastada contra estigmas liberando pólen. Em emasculação, anteras são removidos usando uma pinça fina imediatamente após a florzinha abre eo anteras está começando a exsert, mas ainda não tem a vertente pólen ^6-8. Entre os desafios deste último método é a dificuldade em realizar emasculação em um intervalo de tempo entre a abertura estreita e polinização da flor. A duração de abertura e de fecho de uma única flor irá variar dependendo da adesão e as condições ambientais e podem variar de 7 min ^{6-2,5 h 12 em S. italica. Uma vez que o derramamento de pólen ocorre como anteras exsert do flósculo, anteras precisam de ser removidos cuidadosamente e rapidamente, e por conseguinte, é difícil evitar a contaminação devido a auto-polinização. Além disso, como a polinização são realizadas imediatamente após a castração, o número de cruzamentos que podem ser exercidas por pessoa / dia é limitado.}

Como um método alternativo, panículas maduras podem ser mergulhados em água quente para aquecer-matar desenvolvimento grãos de pólen ^9,10,13,14, com a vantagem de realizar cruzamentos em um grande número de panículas. No entanto, a temperatura e duração do tratamento térmico varia largamente a partir de experiências diferentes (por exemplo, 47 ° C durante 10 minutos ¹⁴ e 42 ° C durante 20 min) ^10. Além disso, há análises sistemáticas sobre a eficácia do emasculations mediada pelo calor foram publicados. Assim, um padrão e método simples para a realização de cruzamentos genéticos no S. viridis aceleraria muito o desenvolvimento de recursos genéticos e de estabelecimento de S. viridis como um sistema modelo no seio da comunidade de pesquisa.

Relata-se o desenvolvimento e otimização de um protocolo padrão para a realização de cruzamentos genéticos em S. viridis. As plantas são cultivadas em ambientes controlados para sincronizar o desenvolvimento da flor e aumentar a reprodutibilidade do processo. Cruzes são realizadas utilizando um S. transgénico A linha viridis como o progenitor masculino que contém o gene repórter GUS ⁴ para facilitar a identificação de cruzamentos genéticos controlados sucesso. O transgene GUS é accionado por um promotor de ubiquitina de arroz, que permite a contagem de sementes F1 imediatamente após a colheita e, assim, proporciona um ensaio qualitativo fácil de determinar a eficiência de emasculação e polinização. Nós empregamos um tratamento térmico simples, com água morna para emasculação acompanhada de rotulagem de flores que foram emasculated para eliminar as sementes resultantes de flores recém-desenvolvidos após a emasculação. Depois de testar uma série de tratamentos térmicos a temperaturas permissivas, e variando o tempo de imersão em água quente, nós estabelecemos a uma temperatura e tempo ideais durações de 48 ° C, 3-6 min. Um tratamento a frio madrugada foi encontrado para promover a antese síncrono em ambos os progenitores, de modo a facilitar a polinização cruzada. Também discutimos os principais passos no protocolo ea futura aplicação deste método a outras adesões Setaria.

Protocolo

1. Crescimento de S. viridis

1. Definir as condições da câmara de crescimento a 31 ° C/22 ° C (dia / noite), 12 hr light/12 hr escura, 50% de umidade relativa do ar com um tratamento antes do amanhecer de 15 ° C 08h30-09:00 AM. (Figura 1). Sob estas condições, S. viridis A10.1 demora cerca de 21-22 dias de semeadura para a antese.
2. Preencha apartamentos (4 x 9 células) com Metro Mix 360 e remover uma célula para a rega.
3. Água levemente névoa na superfície do solo.
4. Semear as sementes na superfície do solo, uma semente por célula.
5. Cobrir as sementes com uma camada de solo (cerca de 0,5 cm)
6. Pulverizar a superfície de apartamentos de solos e de água a partir do fundo. Mantenha a rega de baixo após semeadura.
7. Para cada transversal que vai ser executado pelo menos três plantas vão ser utilizados como parentais femininos e nove plantas vão ser utilizadas como os pais do sexo masculino. Semeadura deve ser escalonada, como todas as plantas não florescem no mesmo dia. Sowi Sementeng é recomendada a cada dia durante um período de três dias.
8. Molhar as plantas de 1-2 vezes por dia, o que é dependente do tamanho das plantas e as condições do solo. O excesso de água no solo não é favorável para o crescimento óptimo das plantas, e pode levar ao crescimento de fungos no solo e os danos de tecido foliar.
9. Fertilizar as plantas duas vezes por semana, usando Jack 15-16-17, a uma concentração de 100 ppm.

2. Aparar e Rotulagem de panículas Antes emasculação - Dia 1

1. Na parte da tarde ou noite antes da polinização, mover as plantas da câmara de crescimento para o laboratório (A temperatura (T): 24,06 ° C ± 0,13 ° C, humidade relativa (HR) 21,79% ± 1,15%).
2. Selecione as panículas primários com 1 flor para 1/3 das flores na panícula que já floresceu.
3. Neste estudo, os quatro domínios dentro da panícula são definidos como se segue (Figura 2A; ponta, meio distai, média e proximal de base).
4. Idealmente, choosea panícula com 1-5 flores que floresceram, cortou a ponta da panícula (extremidade distal) e remova todas as flores nas seções média e base proximal usando tesoura primavera ou uma pinça fina.
5. Se uma panícula tem cerca de 1/10 a 1/5 de flores que floresceram, cortou a ponta e cortar flores a partir da base da panícula, apenas manter a parte inferior da parte superior do meio proximal meio distal e para aparar mais.
6. Se uma panícula tem cerca de 1/4 a 1/2 de flores que floresceram, cortou a parte do meio distal e apenas reter a parte do meio proximal para posterior corte.
7. Use uma tesoura cirúrgica para aparar levemente as cerdas.
8. Remova todas as flores que floresceram e todas as flores imaturas deixando aproximadamente 20-30 flores / panícula que estão uniformemente distribuídas na região (Figura 3). Praticar o cuidado de manter as cerdas da região que irá ser polinizadas para proteger florzinhas de possíveis danos provocados pelo calor.Para cada espigueta, manter a florzinha mais maduro superior. Maioria floret superior terá uma maior probabilidade de antese no momento da polinização (Figura 2B).
9. Marque um lado de cada flor com um marcador permanente vermelho e registrar o número de floretes na panícula (Figura 2B).
10. Bandeira da panícula com as seguintes informações: a data de emasculação, a duração e a temperatura à qual a emasculação é realizada.
11. Uma vez que a panícula é aparado, remova todos os perfilhos de cada planta para garantir a realocação de mais recursos para o desenvolvimento da panícula principal.

3. Emasculação com água quente-dipping - Dia 1

1. Definir o banho de água a 48 ° C ± 0,1 ° C durante o tratamento térmico.
2. Dobre as panículas aparadas e mergulhá-los em água quente a 48 ° C por 3-6 min. Tenha cuidado para não quebrar o caule da panícula.
3. Cerca de 3-4 panículas podem ser mergulhados togeterap de uma só vez, enquanto se mantém um espaço suficiente entre as panículas para distribuição uniforme de calor. É essencial para submergir toda a panícula de água quente durante o tratamento térmico. A folha bandeira (a folha que subtende a panícula que fornece os nutrientes para o panícula) não deve entrar em contato com a água quente para evitar danos causados ​​pelo calor de tecido foliar.
4. Uma vez que a castração é realizada durante o período desejado, remover panículas do banho-maria e gentilmente sacudir a água da panícula.
5. Coloque um saco de pão microfurada personalizado para cobrir integralmente a panícula castrado e prenda-o com um toque de desempate. Sacos de pão micro-perfurados podem ser personalizados de acordo com o tamanho da panícula (inclua no vídeo).
6. Coloque plantas de volta na câmara de crescimento até o dia seguinte.

4. Crossing / polinização após emasculação - Dia 2 e Dia 3

1. Às 09:00 no dia 2 e dia 3, mova feminino (castrado) e male os pais a partir da câmara de crescimento para o laboratório (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, HR: 21,79% ± 1,15%) para realizar cruzamentos.
2. Observe e adicionar outro ponto vermelho para as flores que floresceram ou estão florescendo usando um marcador permanente vermelho. Registre o número total de flores floresceram por panícula.
3. Registre a data da polinização e do nome do pai masculino na etiqueta para acompanhar o que as cruzes são executadas.
4. Observe o horário de pico da antese em genitores masculinos. Nas nossas condições de câmara (Figura 1) flores nas panículas do progenitor masculino começam abertura síncrona em torno de 10:10. Desde o momento da abertura das flores, a exerção completa de anteras e liberação de pólen ocorrerá após 20 min.
5. O palco ideal para a polinização é a fase em que o pólen do progenitor masculino é liberada. As flores vão fechar depois de 20 min de liberação de pólen. Assim, a duração da antese é de cerca de 40 min a partir do momento da abertura de escoamentoers. A cor muda de pólen de branco a castanho-amarelado durante um período de cerca de 30 min depois da flor fecha.
6. Comece imediatamente uma vez que a polinização anteras brancas amareladas são visíveis em flores do progenitor masculino. Polinizações são realizadas no dia 2 e dia 3, utilizando uma das três técnicas:
   1. Panícula-to-panícula polinização: usando uma panícula destacado como o macho, esfregue suavemente a panícula, juntamente com a panícula castrado para facilitar a polinização e descartar a panícula macho para evitar a contaminação. Repita o processo de polinização, até que cada panícula castrado foi polinizada por 2-3 panículas.
   2. Antera-se estigma polinização: usando uma pinça pegar uma flor que está florescendo com anteras brancas amareladas ou pegar anteras e fisicamente tocar o estigma da flor sobre o pai do sexo feminino. Use uma flor do progenitor masculino para polinizar uma flor na panícula castrado. Repita a polinização process até que cada um estigma na panícula castrado foi polinizada por alguns (cerca de 2-3) flores / anteras. Vestindo um visor de aumento tornará melhor visibilidade para realizar a polinização.
   3. Entre as polinizações de diferentes genitores masculinos, mergulhe a pinça em etanol a 95%, seguido por limpeza com Kimwipes para evitar a contaminação devido à transição de pólen entre os diferentes cruzamentos.
   4. Ligação de panículas: Após emasculação, selecione 3-4 panículas no progenitor masculino que florescem no dia seguinte. Uni-los com a panícula emasculado do pai fêmea utilizando um twist-tie. Posicione o panícula emasculado ligeiramente abaixo da panícula do progenitor masculino. Coloque um saco glassine nos panículas e segura o saco na base com um clipe de papel. Isto pode ser concluído no dia 2 uma vez que as panículas de o progenitor masculino começam a antese.
   5. Durante o tempo em que floresce na manhã do dia 2 e dia 3, filme ou sacuda o saco glassine para facilpolinização lite. Continue a apertar ou agitar panículas a cada 15 minutos durante todo o período da antese na parte da manhã (entre as 9:00 AM-11: 00 AM). Remover panículas do progenitor masculino após a polinização e rotular o lado oposto das flores floresceu na panícula castrado. Anote o número de flores floresceram na panícula de cada progenitor feminino.
7. Uma vez que a polinização tem sido realizada, coloque um saco de pão microfurada personalizado para cobrir a panícula do progenitor feminino e seguro na base usando um twist-tie após a polinização até a colheita de sementes.

5. Colheita de Sementes

1. Colheita das sementes após 2 semanas (14-16 dias), desde o dia da polinização. Colocar a etiqueta no mesmo saco de sementes. Sementes que têm marcas vermelhas em ambos os lados representam as sementes que resultaram do cruzamento genético controlado. Estes deverão ser progênie outcross.
2. Descarte as sementes sem manchas vermelhas, pois representamas sementes que resultam de flores recém-desenvolvidos depois de emasculação. Sementes com marcas vermelhas apenas de um lado, provavelmente, representam as sementes resultantes da auto-polinização, pois não foram floração na altura em que os cruzamentos controlados foram realizados.
3. Sementes secas a 30 ° C durante 2 dias num secador de sementes. Armazenar sementes secas em laboratório (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, HR: 21,79% ± 1,15%) ou em uma câmara de semente (T: 4.0 ° C ± 1,0 ° C, RH: 20% ± 1%).

Resultados

Neste estudo, foi utilizado o S. seqüenciado viridis A10.1 adesão como o pai do sexo feminino, e um S. transgênico linha viridis (também A10.1) contendo o gene repórter GUS ⁴ como o progenitor masculino para todas as polinizações. Um regime de crescimento optimizado foi utilizado para sincronizar a floração como mostrado na Figura 1. Nós testamos várias combinações de temperatura e tempo de tratamento térmico para a emasculação e observou que cerca de 40-80% das flores retidos na panícula emasculado floresceu no 2 ^º dia, enquanto o restante floresceu no 3 ^º dia (Figura 2). No entanto, se o tratamento térmico foi muito grave, por exemplo, 49 ° C por 4 min, muito poucas ou nenhumas flores floresceu no 2 ^º dia. A polinização cruzada foi realizada no 2 ^º ou 3 ^º dia após a emasculação, que era dependente do horário de pico da antese de pais masculinos.

Foi observáveled que os jovens flores continuou a se desenvolver após a emasculação, amadurecido e auto-polinizadas polinizações 3-6 dias depois de controladas. Depois de 7-10 dias pós-polinização, as flores que são de cor branca são visíveis na panícula. Estas flores brancas são não fertilizados, quer devido a danos causados ​​pelo calor ou pobre polinização. Ao mesmo tempo, as flores que foram polinizadas com sucesso começam a dar sementes escuras e comece a quebra depois de 14 dias. As sementes escuras com marcas vermelhas colhidas no 14 ^º dia após a polinização pode ser claramente distinguida das sementes sem manchas vermelhas que ainda estavam verdes e não quebrar. Se a colheita é retardada, o anthecium das sementes com e sem marcas vermelhas tanto ficar escuro, o que torna difícil distinguir rapidamente as sementes com marcas vermelhas em piscinas colhidas.

Para optimizar o protocolo de passagem de várias experiências de tratamento térmico foram efectuados tal como resumido na Tabela 1. Uma média de0-10 sementes / panícula foram recuperados a partir de vários experimentos de tratamento térmico. Após a colheita, as sementes foram secas a 30 ° C durante 2 dias num secador de sementes, seguido pela remoção do anthecium usando um removedor anthecium. Após a anthecium foi removido, as sementes F1 putativos foram corados com solução de coloração GUS, e progênie outcross manchado cor azul em 1-2 horas (Figura 2F). Com base nesses resultados, recomendamos um tratamento térmico de 48 ° C por 3-6 min. Além disso, recomendamos que cruzes ser realizada em ambos os dias 2 e dia 3 seguinte emasculação.

Para examinar a eficácia desta técnica na realização de cruzamentos com outras adesões Setaria ou espécies, cruzamentos entre S. viridis A10.1 e oito diversificada S. adesões viridis e um S. adesão pumila foram realizados. Apesar de dias para o florescimento variou entre os acessos, descobrimos que as flores de todos os oito S. adesões viridis e um S.adesão pumila começam abertura entre 10:00-11:00 com um tempo de abertura pico em 10:20-11:00 após o tratamento pelo frio da madrugada. Isto indica que o tratamento a frio da madrugada pode ser aplicada a diversas adesões Setaria. Um tratamento térmico de 48 ° C durante 5-6 min foi usado para castrar S. viridis A10.1, que foi utilizada como o progenitor feminino, para todos os cruzamentos realizados. Recuperamos de um a 12 sementes de cruzamentos entre A10.1 e três do diverso S. adesões viridis e seis sementes de um único cruzamento entre S. viridis A10.1 e uma única S. adesão pumila. No entanto, neste momento, não ter determinado se estes semente resultou de uma testcross sucesso ou foram o resultado de auto-contaminação. Independentemente disso, estes resultados preliminares sugerem que as condições de crescimento usadas para S. viridis A10.1 pode ser usado para gerar cruzamentos com diversas S. adesões viridis e, possivelmente, outras espécies de Setaria.

Temp tratamento térmico (° C)	Tempo de tratamento térmico (min)	# cruzes	Médio. # De flores depois da guarnição	Dia da polinização (dia depois emasc)	Médio. # sementes (vermelho) / panícula (média)	Médio. Gus% (+) / sementes (vermelho)	Médio. Sementes # hyb (Gus +)	Min. # Hyb sementes	Max # hyb sementes
47	10	2	27	2 º dia	0	0	0	0	0
48	3	3	36	2 º dia	5	60	3	1	5
	4	3	25	3 º dia	10	50	5	3	7
	5	8	25	2 º dia	5	60	3	1	6
	6	3	25	2 º dia	4	75	3	0	4
	7	4	24	2 º dia	3	33	1	0	4
	7	1	25	3 º dia	4	75	3	N / D	N /A
49	1	3	23	2 º dia	5	25	1	0	2
	2	7	26	2 º dia	8	25	2	0	4
	3	5	22	2 º dia	0	0	0	0	1
	4	4	25	2 º dia	0	0	0	0	0

Tabela 1. Optimização do tratamento térmico para a emasculação. Resulta da alteração da temperatura e tempo de tratamento térmico. Polinizações foram realizadas um (2 ^º dia) ou dois dias (3 ^º dia) após a emasculação e cruzamentos bem sucedidos sendocarpo com coloração GUS

Figura 1. São mostrados otimizados condições da câmara de crescimento com um pré-tratamento madrugada fria. Temperatura e períodos de tempo para o crescimento ideal e sincronia de produção de flores. Setas verdes e vermelhas mostram a janela ideal para a realização de cruzamentos e emasculação, respectivamente.

Figura 2. Preparação de panículas por cruzamento e GUS coloração de progênie outcross. (A) A panícula de Setaria viridis A10.1 antes de cortar, mostrando aproximadamente 1/10 de flores abertas. As quatro seções e direcionalidade na progressão da antese ao longo da panícula é mostrado. (C) Uma panícula castrado após a remoção dos pêlos. (D) Uma panícula castrado no dia 2 pós-castração, mostrando as flores que estão florescendo (foto tirada às 10:30 AM). (E) A panícula do progenitor masculino (transgênico Setaria viridis linha A10.1 carregando uma β-glucuronidase (GUS) gene repórter) que está florescendo após o tratamento antes do amanhecer (foto tirada às 10:30 AM). A a E, barra de escala = 1 mm. (F) progenitura outcross putativos após coloração GUS, durante 2 horas, seguido por distaining em 70% (v / v) de etanol. As duas sementes do direito são controles negativos e positivos, respectivamente.

Figura 3. Gráfico do protocolo de Fluxo Uma representação esquemática do mRINCIPAIS etapas envolvidas na realização S. viridis atravessa.

Discussão

Importância do tratamento antes do amanhecer

Para obter uma alta freqüência de progênie outcross é essencial ter antese altamente síncrona de pais masculinos e femininos. Inicialmente, pedalamos regimes de temperatura e luz (31 ° C/22 ° C, dia / noite) e usou o S. viridis A10.1 adesão para todas as polinizações. Sob essas condições, a maioria das flores abrem de manhã cedo antes que a temperatura sobe para 31 ° C, embora algumas flores abertas aleatoriamente entre 8h00-8: 00 PM. Estudos anteriores em S. italica indicam que hora do dia, local e época contribuir para a variação em antese ^7,15,16. Siles et al. ⁶ observou que a antese foi associada com variações bruscas de temperatura e umidade, mas não com baixa temperatura e alta umidade, por si só, como concluiu em estudos anteriores ^7,15. Por isso, nós empregamos um pré-tratamento do amanhecer frio de 15 ° C por 30 min (das 8:30 AM-9: 00 AM) para imitara condição de pré-amanhecer natural. Este tratamento frio da madrugada auxiliado na sincronização antese nos pais. Observou-se que, apesar de a câmara de ajuste para níveis de humidade relativa de 50%, a humidade relativa no interior da câmara aumentou para um nível superior a 70% quando a temperatura caiu de 22 ° C a 15 ° C e continuou a manter acima de 70% até a temperatura gradualmente subiu para 31 ° C depois de 9:30. Às 9:00 AM, emasculado genitores femininos e plantas do progenitor masculino são levados para o laboratório (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%). As flores dos genitores masculinos começar a abrir em torno de 10:10, ea polinização pode ser realizada às 10:30 AM-11: 00 PM. Uma lista detalhada de todos os reagentes e equipamento é fornecido na Tabela 2.

Importância da preparação panícula para emasculação

Sob as condições da câmara neste estudo (Figura 1), o tempo de floração panícula primário variou de2-3 dias. Tipicamente, flores localizados no meio distal da inflorescência (Figura 2A) aberto primeira abertura e precede proximal e distal. O número ideal de flores a serem retidos na panícula é 20-30. O cuidado deve ser tomado durante a remoção de flores imaturas para que apenas flores bem desenvolvidos (a flor superior ou maiores na espigueta ¹⁷⁾ são mantidas. A marcação com marca vermelha em ambos os lados das flores ajuda a distinguir eficientemente progenitura outcross putativo a partir de sementes de flores recentemente desenvolvidos após a castração. Além disso, é importante para deixar as cerdas sobre as panículas antes emasculação para proteger as florzinhas de danos extensos de calor, no entanto, como uma opção, que pode ser removido após a emasculação usando tesouras de mola, a fim de facilitar a polinização, especialmente quando a ligação de um panícula técnica é utilizada (Figuras 2C e 2D).

Optimizado uma temperaturaduração do tratamento d para tratamento de água quente

A base para a castração através de imersão de água quente é que o pólen é mais sensível ao calor do que a superfície estigmática. No entanto, a duração ea temperatura de tratamento térmico pode variar entre as espécies Setaria e adesões. Em geral, uma temperatura mais elevada, com um tempo de tratamento mais curto, ou uma temperatura mais baixa, com um tempo de tratamento mais prolongado terá o mesmo efeito sobre a emasculação. Tem sido relatado que um tratamento térmico de 42 ° C durante 20 min ou ¹⁰ a 47 ° C durante 10 min ¹⁴ rendeu S. italica pólen não viáveis, mas a eficácia destes tratamentos não foi determinada. Nós desenvolvemos o nosso protocolo seguindo a hipótese de que, sob uma temperatura otimizada e duração do tratamento, o pólen de todas as flores retida no progenitor feminino será inviável enquanto estigmas permanecerá receptivo. No entanto, depois de comparar e analisar os efeitos de diferentes temperaturas eperíodos de tratamento (Tabela 1), observou-se que a sensibilidade ao tratamento pelo calor varia entre as flores retidos em cada panícula, portanto, é difícil de eliminar completamente as sementes resultantes da auto-polinização. Conclui-se que a eficiência de produção de descendência cruzamento aberto é a maior quando os tratamentos são efectuados a 48 ° C durante 3-6 min em S. viridis A10.1 adesão.

Horário de pico de antese e polinização cruzada

Quando as flores atingem a maturidade e está prestes a abrir, as anteras são de cor branca amarelada na cor e pólen é derramado assim que as anteras das flores exsert ^8. Anteras gradualmente virar marrom após pólen é derramado como as flores começam a fechar. Uma vez liberado, a viabilidade do pólen é desconhecida. Assim, é crítica a utilização do pólen de abertura ou as flores recém abertas com o progenitor masculino o mais rapidamente possível. Nas nossas condições de câmara (Figura 1), a maioria das flors dos genitores masculinos começam a abrir às 10:10 e as flores abertas lançar pólen às 10:30. Assim, a janela desejável para a realização de polinização é 10:30-11:00. Os estigmas permanecem fora das glumas após flores perto e pode ser receptivo ao pólen. Isto tem sido observado anteriormente e confirmada em S. italica que os estigmas são receptivos por cerca de 48 horas de abertura pós-flor por Siles et al. ^6, por isso é importante saco panículas após tratamento térmico e após a realização de cruzamentos controlados. Como discutido acima, recomendamos polinizações desempenho em ambos os dia 2 e dia 3 pós-castração.

Métodos para a polinização

Comparou-se a eficiência de três técnicas de polinização. Se flores desabrochando não se limitando, a polinização panícula-to-panícula é a técnica mais eficiente e irá produzir um maior número de descendentes outcross. Se panículas florescendo estão limitando, uma maior frequência de outcross progénie será produzida quando o método de antera a-estigma é usado. Obtivemos progênie outcross de ambos os métodos de sucesso. O método "panículas ligação" tem sido utilizado na travessia S. italica ^6, mas nós achamos que este método seja o método menos eficiente quanto a janela de tempo para o derramamento de pólen do progenitor masculino é curto. Além disso, há menos controlo sobre a polinização e as cerdas em S. panículas viridis também pode dificultar o movimento do pólen na superfície estigmática.

Colheita da semente, a secagem e armazenamento

Após a colheita, as sementes devem ser secos a 30-33 ° C durante 2 dias. Anthecium deve ser removido para a coloração de GUS, se necessário. As sementes devem ser armazenados em local fresco e seco (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%) para o armazenamento de curto prazo (menos de dois anos) ou em uma câmara de semente (T: 4.0- 10 ° C ± 1,0 ° C, RH: 20% ± 1%) para o armazenamento a longo prazo.Más condições de armazenamento pode resultar em taxas de viabilidade baixos ^8. Temos observado que a taxa de germinação de sementes de S. viridis A10.1 é de aproximadamente 5% quando semeadas quatro dias após a colheita, mas pode ser aumentado para 90-96% depois da armazenagem em laboratório (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, HR: 21,79% ± 1,15%) para 110 dias pós-colheita seguido por uma estratificação de três dias a -80 ° C para quebrar a dormência das sementes. Para a estratificação a -80 ° C, sementes secas pode ser colocado em um recipiente hermeticamente fechado (por exemplo, tubo de micro-centrifugação ou envelope moeda num saco de plástico selado) e mantida a -80 ° C durante 3 dias antes do plantio. Após 16 meses de armazenamento em laboratório (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%), os percentuais de germinação de 90-95% ainda pode ser obtida. Além disso, para quebrar a dormência, as sementes podem ser secos a 30-33 ° C durante 2 dias após a colheita, e, em seguida, dada de três dias a estratificação a -80 ° C seguido pela remoção deanthecium antes de plantar. Após estes tratamentos, as taxas de germinação da semente até 33% pode ser conseguido.

Vantagens, limitações e possíveis modificações

Aqui nós fornecemos o primeiro protocolo padrão para a realização de cruzamentos em S. viridis A10.1 usando um tratamento térmico para emasculação. Em contraste com a castração física, este protocolo é menos invasivo e relativamente fácil de estabelecer em um laboratório. Geralmente, leva cerca de 15 minutos para cortar uma panícula e cerca de 15 panículas podem ser aparadas e cruzou / pessoa / dia. Assumindo uma média de 3-5 outcross progênie / panícula pode ser recuperado em condições otimizadas, um total de 45-75 progênie outcross pode ser produzido por uma pessoa em um único dia. Além disso, esta técnica pode ser aplicada a atravessa, em outras espécies de Setaria, embora optimizações adicionais serão susceptíveis. Se o espaço em câmara de crescimento é limitado, as plantas podem ser cultivadas em casa de vegetação ou câmaras de crescimento, sem um tesouro pré-amanhecertamento até a panícula emerge antes de serem transferidas para as condições da câmara otimizados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tesoura, mola	World Precision Instruments, Inc	14126
Fórceps, Dumostar Biology Polido	SPI Supplies	TD5BP-XD
Tesoura Cirúrgica	F.S.T (Fine Science Tools)	14005-12
Sacos de Pão Crocantes Microperfurados de Polipropileno Transparente Europack 6"x28"	http://www.pjpmarketplace.com	361001
Flats	T.O. Plastics	715401C
metro mix 360	Hommert International	10-0356-1
Jack's 15-16-17	Hommert International	07-5925-1
Kimwipes	VWR International	34120
Marcadores Permanentes de Ponta Ultra Fina Sharpie,	Grampos Vermelhos	37002
Donegan DA-10 OptiVisor Lupa de Cabeça, Ampliação de 3.5x, Distância Focal de 4"	Amazon	DA-10, B0015IP380
12"24/7 Embalagem Seladora de Impulso Manual Máquina de Selagem a Calor Elemento Livre de Vedação de Poli Amazon		N/A
banho-maria	VWR Modelo científico	: 1166
BDW caminhada na câmara de crescimento de plantas	Conviron	BDW 40