Viva Imagem Ensaio para Avaliação das Funções de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; E esfingomielinase na reparação de Pore-formando feridas Tóxicas

Resumo

Imagens ao vivo de células expostas ao corante lipofílico FM1-43 permite a determinação precisa da cinética pelo qual as toxinas formadoras de poros são removidas a partir da membrana plasmática. Este é um ensaio sensível, que pode ser usado para avaliar os requisitos para Ca ^{2 +,} esfingomielinase e outros factores de reparação da membrana plasmática.

Resumo

Lesão da membrana plasmática é um evento freqüente e feridas têm de ser rapidamente reparado para garantir a sobrevivência celular. Influxo de ^{Ca2 +} é um evento chave de sinalização que desencadeia a reparação de feridas mecânicas na membrana de plasma no interior ~ 30 seg. Estudos recentes revelaram que as células de mamíferos também selar sua membrana plasmática após permeabilização com poros formando toxinas em um processo de ^{2 +} dependentes de Ca que envolve a exocitose da esfingomielinase ácida enzima lisossomal seguido por poro endocitose. Aqui, nós descrevemos a metodologia utilizada para demonstrar que os fechos das células permeabilizadas pela toxina estreptolisina também é rápida e dependente de influxo de ^{Ca2 +.} O desenho do ensaio permite a sincronização do evento lesão e uma medição precisa da cinética da capacidade de células para restaurar a integridade da membrana plasmática por imagem e quantificar o grau pelo qual o corante liphophilic FM1-43 às membranas intracelulares. Este live als ensaioo permite uma avaliação da sensibilidade da capacidade de exogenamente adicionados factores solúveis, tais como a esf ingomielinase para inibir a FM1-43 afluxo, que reflecte a capacidade de células para reparar a sua membrana plasmática. Este ensaio permitiu demonstrar pela primeira vez que esfingomielinase actua a jusante de Ca ^{2 +} dependente de exocitose, desde adição extracelular da enzima promove a re-selagem de células permeabilizadas, na ausência de Ca ^{2 +.}

Introdução

Ele tem sido conhecido há várias décadas que o reparo da membrana plasmática após a lesão mecânica é um ^1,2 Ca ^{2 +} processo-dependente. Estudos posteriores mostraram que o influxo de ^{Ca2 +} através da ferida provoca um processo de vigorosa de exocitose de vesículas intracelulares no local da lesão, que é necessária para selar ^3,4. A taxa de perda de um corante fluorescente carregados para o citoplasma das células foi usada para avaliar a velocidade de reparação, e concluiu que resselagem foi completada dentro de <30 seg após a lesão ^5. Dois modelos foram inicialmente propostos para explicar a exigência de exocitos....

Protocolo

1. Transcricional silenciamento de ASM

1. Semente de 1,5 x 10 ⁵ células HeLa em 2 ml de DMEM meio de crescimento (DMEM de alto teor de glucose com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 1% de Penn-Strep) em pratos de fundo 35 milímetros de vidro (MatTek) e incubar durante a noite a 37 ° C numa atmosfera de 5% de _CO2.
2. No dia seguinte, aspirado de fora os meios de crescimento e substituí-la com 2 ml de DMEM reduzida meio de soro (DMEM com 4% de FBS), pelo menos 1 hr antes de adicionar a mistura de transfecção siRNA.
3. Prepare quatro tubos para a mistura de oligo transfecção siRNA. Em tubos A e C, adicionar 2....

Resultados

Baixas concentrações de reparo da membrana plasmática bacteriana esfingomielinase (SM) de resgate em células empobrecido em esfingomielinase ácida lisossomal.

Usando o ensaio de imagiologia FM1-43, que mostraram previamente que as células deficientes para a enzima lisossomal ASM e expostas a SLO ferindo na presença de ^{Ca2 +} têm um defeito membrana plasmática é resgatado pela adição extracelular da enzima humana recombinante ^19. Desde o ASM lisossomal humana tem um pH óptim.......

Discussão

Estudos anteriores sobre o prejuízo e membrana plasmática reparo mecânico contou com diversos mecanismos de células ferindo, desde soltando pérolas de vidro, micropipetting, corte, arranhão ou raspagem. A leitura de todos estes ensaios foi qualitativa do que quantitativa, e não dar informações precisas sobre a cinética do mecanismo de reparo. A capacidade das células para voltar a selar a sua membrana de plasma após estas formas de lesão foi medida através da presença ou ausência de marcadores adicionados ao fluido extr.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente
HeLa 229 linha celular	ATCC	CCL2-1
DMEM Alta Glicose	Invitrogen	11965
DMEM Alta Glicose Sem Cálcio	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem Soro Reduzido	Invitrogen	31985
Lipofectamina RNAiMax	Invitrogen	13778
Conteúdo médio de controle GC RNAi oligo	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi oligo	Invitrogen	HSS143988
Soro bovino fetal Inativado por calor	Gemini-Bioproducts	100-106
Esfingomielinase de Bacillus cereus	Sigma	S7651
Pratos de fundo de vidro de 35 mm	MatTek	P35G-0-14
Material
Microscópio invertido	Nikon	Eclipse Ti
Camera	Hamamatsu Photonics	C9100-50
Microscópio confocal de disco giratório	PerkinElmer	UltraViewVoX
Análise de software software	PerkinElmer	Volocity Suite
Câmara ambiental	Dispositivos de patologia	Câmara do sistema

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