Viva Imagem Ensaio para Avaliação das Funções de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; E esfingomielinase na reparação de Pore-formando feridas Tóxicas

Resumo

Imagens ao vivo de células expostas ao corante lipofílico FM1-43 permite a determinação precisa da cinética pelo qual as toxinas formadoras de poros são removidas a partir da membrana plasmática. Este é um ensaio sensível, que pode ser usado para avaliar os requisitos para Ca ^{2 +,} esfingomielinase e outros factores de reparação da membrana plasmática.

Resumo

Lesão da membrana plasmática é um evento freqüente e feridas têm de ser rapidamente reparado para garantir a sobrevivência celular. Influxo de ^{Ca2 +} é um evento chave de sinalização que desencadeia a reparação de feridas mecânicas na membrana de plasma no interior ~ 30 seg. Estudos recentes revelaram que as células de mamíferos também selar sua membrana plasmática após permeabilização com poros formando toxinas em um processo de ^{2 +} dependentes de Ca que envolve a exocitose da esfingomielinase ácida enzima lisossomal seguido por poro endocitose. Aqui, nós descrevemos a metodologia utilizada para demonstrar que os fechos das células permeabilizadas pela toxina estreptolisina também é rápida e dependente de influxo de ^{Ca2 +.} O desenho do ensaio permite a sincronização do evento lesão e uma medição precisa da cinética da capacidade de células para restaurar a integridade da membrana plasmática por imagem e quantificar o grau pelo qual o corante liphophilic FM1-43 às membranas intracelulares. Este live als ensaioo permite uma avaliação da sensibilidade da capacidade de exogenamente adicionados factores solúveis, tais como a esf ingomielinase para inibir a FM1-43 afluxo, que reflecte a capacidade de células para reparar a sua membrana plasmática. Este ensaio permitiu demonstrar pela primeira vez que esfingomielinase actua a jusante de Ca ^{2 +} dependente de exocitose, desde adição extracelular da enzima promove a re-selagem de células permeabilizadas, na ausência de Ca ^{2 +.}

Introdução

Ele tem sido conhecido há várias décadas que o reparo da membrana plasmática após a lesão mecânica é um ^1,2 Ca ^{2 +} processo-dependente. Estudos posteriores mostraram que o influxo de ^{Ca2 +} através da ferida provoca um processo de vigorosa de exocitose de vesículas intracelulares no local da lesão, que é necessária para selar ^3,4. A taxa de perda de um corante fluorescente carregados para o citoplasma das células foi usada para avaliar a velocidade de reparação, e concluiu que resselagem foi completada dentro de <30 seg após a lesão ^5. Dois modelos foram inicialmente propostos para explicar a exigência de exocitose no reparo da membrana plasmática: 1) o modelo de "patch", que sugeriu que influxo de ^{Ca2 +} através da lesão desencadeia fusão inicialmente homotipica de vesículas intracelulares, formando um grande "patch" que faria em seguida, ser aplicado para a membrana plasmática para selar a ferida ⁶ e 2) o modelo de redução de tensão, que propôs que a membrana added por Ca ^{2 +} dependente de exocitose na vizinhança da ferida iria reduzir a tensão da membrana plasmática, o que facilita a nova selagem da bicamada ^7. O papel do Ca ^{2 +-exocitose} desencadeado no reparo da membrana plasmática foi reforçada por estudos que mostram que os lisossomos contêm uma molécula de Ca ^{2 +} sensor, sinaptotagmina VII, o que facilita a sua exocitose e reparo da membrana plasmática das células lesadas ^8,9,10,11 .

No entanto, a evidência adicional indicou que exocitose por si só não foi suficiente para promover a reparação da membrana plasmática. Além lágrimas mecânicas na membrana do plasma, uma forma comum de lesão celular é a permeabilização de toxinas formadoras de poros produzidos por bactérias ou células imunitárias ^{12,13 14,15.} Ao contrário de lágrimas mecânicos, proteínas formadoras de poros se inserir na membrana plasmática formando uma poro revestido a proteína estável, que não pode ser fechado de novo, simplesmente por aplicação de uma membrana de "remendo" ou por reduçãoção de tensão de membrana. Curiosamente, os estudos revelaram que as células de mamíferos têm um mecanismo eficaz para reparar a sua membrana de plasma após a permeabilização com proteínas formadoras de poros, e esse processo também requer a presença de extracelular de Ca ^{2 + 12.} Esta descoberta levantou a questão de saber se a remoção transmembranar poros da superfície da célula, também é um processo rápido, tal como observado com feridas mecânicas ^5. Surpreendentemente, os nossos estudos recentes mostraram que a nova selagem de células permeabilizadas com toxinas formadoras de poros tem propriedades muito semelhantes às da reparação de feridas mecânicas: o processo requer extracelular de Ca ^{2 +,} e é completado dentro de ~ 30 segundos. Investigando esse processo com mais detalhes, que recentemente descobriu que, além de Ca ^{2 +} exocitose regulada de lisossomos, reparo da membrana plasmática envolve uma forma rápida de endocitose, que é desencadeada pela liberação da enzima esfingomielinase ácida lisossomal (ASM) e é essencial não só para poe remoção dos poros transmembranares, mas também para a reparação de feridas mecânicos ^16.

Para determinar a cinética de relacração celular após permeabilização com proteínas formadoras de poros, em nosso laboratório, adaptado de uma metodologia de imagens ao vivo que tinha sido usado anteriormente para avaliar a nova selagem de fibras musculares isoladas ferido a laser ^17. Este ensaio baseia-se nas propriedades do corante lipofílico FM1-43, que se intercala estavelmente no folheto exterior de bicamadas lipídicas aumento na intensidade de fluorescência. Quando a bicamada da membrana do plasma é interrompido ganhos corante extracelular acesso às membranas intracelulares, fornecendo um ensaio sensível para detecção de lesões da membrana plasmática e reparar ^18,16,19,20. Para adaptar este ensaio para a avaliação de resselagem célula após permeabilização com proteínas formadoras de poros, se as células pré-incubadas a 4 ° C com a toxina bacteriana estreptolisina O (SLO), que se liga ao colesterol da membrana ^21. Célula Synchronouspermeabilização pode, então, ser facilmente conseguido movendo as células de gelo para aquecer meio de uma fase de microscópio aquecida, a qual ativa a oligomerização e as alterações na conformação que leva à formação de poros transmembranares. Uma vantagem desta abordagem, ao longo dos ensaios publicados anteriormente usando o ferimento a laser, é de que um maior número de células podem ser analisadas simultaneamente num campo microscópico, proporcionando uma melhor amostragem da população de células. Dadas as semelhanças entre o processo de mecanicistas resselagem celular observada após a lesão mecânica e permeabilização com toxinas formadoras de poros, o ensaio aqui descrito proporciona um método muito versátil e eficiente para factores envolvidos no processo fundamental de reparação da membrana plasmática de dissecação. Como exemplo, mostra-se que é possível utilizar este ensaio para identificar os passos de Ca ^{2 +} dependente e independente do processo de reparação.

Protocolo

1. Transcricional silenciamento de ASM

1. Semente de 1,5 x 10 ⁵ células HeLa em 2 ml de DMEM meio de crescimento (DMEM de alto teor de glucose com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 1% de Penn-Strep) em pratos de fundo 35 milímetros de vidro (MatTek) e incubar durante a noite a 37 ° C numa atmosfera de 5% de _CO2.
2. No dia seguinte, aspirado de fora os meios de crescimento e substituí-la com 2 ml de DMEM reduzida meio de soro (DMEM com 4% de FBS), pelo menos 1 hr antes de adicionar a mistura de transfecção siRNA.
3. Prepare quatro tubos para a mistura de oligo transfecção siRNA. Em tubos A e C, adicionar 250 uL de Optimem soro reduzida e 4 ul de Lipofectamina RNAiMax, por 35 milímetros prato a ser transfectada. No tubo B, adicionar 250 mL de Optimem reduzido soro e 8 mL (160 pmol) de controle de conteúdo GC médio oligo (Controle siRNA), por 35 milímetros prato a ser transfectadas. Em tubo D, adicionar 250 mL de Optimem reduzido soro e 8 mL (160 pmol) de SMPD1 oligo (siASM), por 35 milímetros prato to ser transfectados. Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 5 min.
4. Combinar os tubos A e B para formar o complexo de transfecção para o Controle de siRNA, e tubos de C e D para o ASM siRNA. Incubar as reacções à temperatura ambiente durante 20 min.
5. Adicionar as misturas de reacção a transfecção de controlo siRNA e ASM siRNA lentamente, gota a gota, para os respectivos pratos de fundo de 35 mm de vidro e incubar a 37 ° C / 5% de CO _2. Às 24 horas após a transfecção, aspirar delicadamente fora da mídia e substitua-o por meio de crescimento fresco DMEM. Para eficiente knockdown ASM, os pratos devem ser ainda incubada a 37 ° C / 5% de CO ₂ durante cerca de 31 horas (total de 55 horas) antes de imagens em tempo real.

2. Preparação de Reagentes para Live Microscopia

1. Prepara-se uma solução de toxina recombinante formador de poros estreptolisina O (SLO), a uma concentração de 100 ng / mL em PBS frio 1x sem Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +.} A SLO utilizado nestes ensaios é um constitutivelmutante y activo cisteína que não requer agentes para reduzir a actividade, gentilmente fornecido pelo Dr. Rod Tweten, University of Oklahoma. A toxina foi expressa em E. coli BL21 DE3 e purificado sob condições nativas, como descrito previamente ^16.
2. Preparar a solução de estoque FM1-43: Ressuspender FM1-43 em pó liofilizado em DMSO para criar uma solução de 25 mM.
3. Preparar a solução de A: Diluir a solução estoque FM1-43 em DMEM frio com Ca ^{2 +} para uma concentração final de 4 | iM (1,5 ml são necessários por MatTek prato) e armazenar em gelo até ser necessária.
4. Prepare a Solução B: Diluir a solução estoque FM1-43 em DMEM frio, sem Ca ^{2 +} e 10 mM de EGTA (Ca ^{2 +-DMEM} livre) para uma concentração final de 4 | iM (1,5 ml necessários por MatTek prato) e armazenar em gelo até necessário.
5. Pré-quente (37 ° C) 1 ml de solução A e solução B, em tubos de Eppendorf.
6. Mantenha em soluções de gelo de DMEM com Ca ^{2 +} e Cum DMEM ² sem ^+.

3. Imagens de células vivas de FM1-43 Influx em SLO tratadas e células não tratadas

1. Encher um recipiente metálico raso de tamanho médio com gelo moído, invertê-lo num recipiente de vidro grande com gelo, e adicionar gelo adicional deixando apenas a superfície do fundo do recipiente de metal exposto. Coloque uma toalha de papel molhado na parte inferior metal exposto para permitir a transferência, mesmo térmica.
2. Pegue um tratado com siRNA controle prato MatTek (Amostra 1) e coloque-a sobre o papel toalha molhada fria. Gentilmente aspirar fora todas as mídias e lavar 3x com frio Ca ^{2 +} livre DMEM. Após a última lavagem, aspirar fora todas as mídias no prato.
3. Para imagem associada à célula FM1-43 em células sem SLO ferida (Exemplo 1) na presença de ^{Ca2 +,} adicionar 180 mL de solução fria B para a lamela de vidro do centro do prato de fundo de 35 mm de vidro e incubar durante 5 min em gelo (Tabela 1).
4. Coloque MatTek prato na plataforma de um microscópio confocal de aquecida a 37 ° C e equipado com uma câmara ambiental (o qual mantém a temperatura, a humidade e os níveis de CO _2). Encontre o campo de células que será fotografada olhando através de um 1,3 objetiva de 40X NA (Nikon). Se estiver disponível, ligue PerfectFocus ou um dispositivo semelhante para corrigir a deriva térmica.
5. Adicionar 1 ml de solução A pré-aquecido suavemente para o lado do prato de 35 mm e substituir tampa do compartimento do meio ambiente (Tabela 1).
6. Adquirir imagens para 4 min a 1 frame a cada 3 s usando software de imagem apropriado (Volocity no sistema de microscopia confocal disco giratório UltraView Vox Perkin Elmer). Excitação de FM1-43 é realizada com uma linha de laser 488 nm, utilizando um filtro dicróico com uma banda de passagem de 488 nm e de emissão de discriminação é conseguido através do uso de um filtro de emissão de 527 (W55). Níveis de potência do laser e sensibilidade da câmara são definidas para atingir exposições de imagem de 100 ms.
7. Repita os passos 3.2 a 3.6 para detectar FM1-43 em células de controlo tratadas com siRNA sem ferimento SLO (Amostra 2), na ausência de ^{Ca2 +,} excepto que devem ser adicionadas no passo 3.5 Solução B (Tabela 1).
8. Para medir a FM1-43 fluxo em células tratadas com siRNA de controlo feridos com SLO quer na presença (Exemplo 3) ou ausência de ^{Ca2 +} (Exemplo 4), adicionar 180 mL de solução fria B contendo SLO para a lamela de vidro do centro 35 mm prato fundo de vidro e incubar por 5 min no gelo como no passo 3.3. Repita os passos 3,2 por 3,6; ajustar adicionando ou Solução A Solução B ou no passo 3.5 (Tabela 1).
9. Para determinar o papel da ASM no reparo da membrana plasmática, repita os passos 3,2-3,6 usando células tratadas com siRNA ASM para todas as condições (amostras 5-8) (Tabela 1).
10. Para determinar o papel de esfingomielinase extracelular recombinante (SM) nacinética de reparação da membrana plasmática (reflectidos pela inibição em FM1-43 afluxo) (Exemplos 9-10), SM é adicionado (0-50 mU), quer da solução A ou solução B na etapa 3.5 e, em seguida, adicionado às células durante células vivas imagiologia de um volume total de 1 ml (Tabela 1).

4. Quantificação de FM1-43 em células Afluxo

1. Após os filmes tenham sido adquiridos, medir a intensidade de fluorescência intracelular de FM1-43 usando o software de análise de imagem (Volocity Suite, PerkinElmer). Desenhar uma região de interesse na região citosólica de cada célula no campo e aplicar as ferramentas de software para determinar a FM1-43 intensidade média de fluorescência ao longo de todos os quadros de vídeo.
2. Para ajustar as variações na inicial FM1-43 coloração, os dados para cada vídeo é expresso como vezes de aumento na intensidade de fluorescência ao longo do tempo, e representada para cada condição diferente. O vezes de aumento na fluorescência de cada ponto de tempo individual porcélula é calculada como F _T / F _0, onde _T é F a fluorescência média no ponto de tempo específico, e F ₀ é a fluorescência média em t = 0 (Figuras 1-2).

Resultados

Baixas concentrações de reparo da membrana plasmática bacteriana esfingomielinase (SM) de resgate em células empobrecido em esfingomielinase ácida lisossomal.

Usando o ensaio de imagiologia FM1-43, que mostraram previamente que as células deficientes para a enzima lisossomal ASM e expostas a SLO ferindo na presença de ^{Ca2 +} têm um defeito membrana plasmática é resgatado pela adição extracelular da enzima humana recombinante ^19. Desde o ASM lisossomal humana tem um pH óptim...

Discussão

Estudos anteriores sobre o prejuízo e membrana plasmática reparo mecânico contou com diversos mecanismos de células ferindo, desde soltando pérolas de vidro, micropipetting, corte, arranhão ou raspagem. A leitura de todos estes ensaios foi qualitativa do que quantitativa, e não dar informações precisas sobre a cinética do mecanismo de reparo. A capacidade das células para voltar a selar a sua membrana de plasma após estas formas de lesão foi medida através da presença ou ausência de marcadores adicionados ao fluido extr...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente
HeLa 229 linha celular	ATCC	CCL2-1
DMEM Alta Glicose	Invitrogen	11965
DMEM Alta Glicose Sem Cálcio	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem Soro Reduzido	Invitrogen	31985
Lipofectamina RNAiMax	Invitrogen	13778
Conteúdo médio de controle GC RNAi oligo	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi oligo	Invitrogen	HSS143988
Soro bovino fetal Inativado por calor	Gemini-Bioproducts	100-106
Esfingomielinase de Bacillus cereus	Sigma	S7651
Pratos de fundo de vidro de 35 mm	MatTek	P35G-0-14
Material
Microscópio invertido	Nikon	Eclipse Ti
Camera	Hamamatsu Photonics	C9100-50
Microscópio confocal de disco giratório	PerkinElmer	UltraViewVoX
Análise de software software	PerkinElmer	Volocity Suite
Câmara ambiental	Dispositivos de patologia	Câmara do sistema

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