Transplante de Progenitores Miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos em modelos de regeneração muscular

Resumo

Progenitores miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) são candidatos promissores para estratégias de terapia celular para tratar distrofias musculares. Este protocolo descreve transplantes e medidas funcionais necessárias para avaliar o enenxerto e diferenciação dos mesoangioblastos derivados do iPSC (um tipo de progenitores musculares) em modelos de camundongos de regeneração muscular aguda e crônica.

Resumo

IPSCs derivados do paciente podem ser uma fonte inestimável de células para futuros protocolos de terapia celular autóloga. Células progenitoras miogênicas/progenitoras derivadas do iPSC semelhantes aos mesoangioblasts derivados de pericílito (células-tronco/progenitoras derivadas do iPSC: IDEMs) podem ser estabelecidas a partir de iPSCs gerados a partir de pacientes afetados por diferentes formas de distrofia muscular. Os IDEMs específicos do paciente podem ser geneticamente corrigidos com diferentes estratégias (por exemplo, vetores lentivirais, cromossomos artificiais humanos) e aprimorados em seu potencial de diferenciação miogênica após a superexpressão do myogenesis regulator MyoD. Esse potencial miogênico é então avaliado in vitro com ensaios de diferenciação específicos e analisado por imunofluorescência. O potencial regenerativo dos IDEMs é ainda avaliado in vivo, notransplante intramuscular e intra-arterial em dois modelos representativos de camundongos que apresentam regeneração muscular aguda e crônica. A contribuição dos IDEMs para o músculo esquelético hospedeiro é então confirmada por diferentes testes funcionais em camundongos transplantados. Em particular, a amenização da capacidade motora dos animais é estudada com testes de esteira. O engrafamento celular e a diferenciação são então avaliados por uma série de ensaios histológicos e imunofluorescência em músculos transplantados. No geral, este artigo descreve os ensaios e ferramentas atualmente utilizados para avaliar a capacidade de diferenciação dos IDEMs, com foco nos métodos de transplante e medidas de desfecho subsequentes para analisar a eficácia do transplante celular.

Introdução

Mesoangioblasts (MABs) são progenitores musculares associados ao vaso derivados de um subconjunto de pericílitos^1-3. A principal vantagem dos MABs sobre progenitores musculares canônicos, como as células satélites^4, reside em sua capacidade de atravessar a parede do vaso quando entregue intra-arterial e, portanto, contribuir para a regeneração muscular esquelética nos protocolos de terapia celular. Este recurso foi avaliado e confirmado em modelos murinos e caninos de distrofia muscular^1,5,6. Esses estudos pré-clínicos construíram as bases para um primeiro ensaio clínico de fase I/II baseado no transplante intra-arterial de MABs idênti....

Protocolo

1. Avaliação do Potencial miogênico e engrafado

1. In vitro: Diferenciação induzida pelo MYOD
   1. Gerar uma linha celular estável de IDEMs transduzidos com o vetor lentiviral myoxifen-ER indutível de tamoxifen, titulando a multiplicidade de infecção (MOI; por exemplo, 1, 5 e 50) utilizando a coloração descrita em 1.1.9 (MyHC) como resultado da eficiência do procedimento.
   2. Cubra um prato de 3,5 cm com 1 ml de 1% de Matrigel e incubar por 30 min a 37 °C.
   3. Lave a placa duas vezes com idem médios e semeados 1 x^{10 5} MyoD-ER transduzidos no prato de cultura tecidual de 3,5 cm e incubar a 37 °C em meio de crescimen....

Resultados

Os resultados representativos relatados seguem os principais ensaios in vitro/in vivo retratados no fluxo de trabalho na Figura 1. 48 horas após 4OH-tamoxifen administração Núcleos myoD-positivos são identificáveis dentro de IDEMs transduzidos myoD-ER na cultura(Figura 2A). As células então se fundem e se diferenciam em miótubos multinucleados(Figura 2B). Quando transplantados intramuscularmente em um modelo murino de lesão muscular aguda, os IDEMs contribuem pa.......

Discussão

Os iPSCs podem ser expandidos indefinidamente, preservando seu potencial de auto-renovação e, portanto, orientados a diferenciar-se em uma ampla gama de linhagens^{celulares 12}. Por essa e outras razões, as células-tronco/progenitoras derivadas do iPSC são consideradas uma fonte promissora para abordagens autólogas de genética e terapia celular¹³. Um trabalho publicado anteriormente pelos Autores relatou a geração de progenitores miogênicos e camundongos humanos de iPSCs com um fenótipo semelhante ao .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
REAGENTS
MegaCell DMEM	Sigma	M3942
DMEM	Sigma	D5671
IMDM	Sigma	I3390
Soro	de cavalo Euroclone	ECS0090L
Soro fetal bovino	Lonza	DE14801F
PBS Livre de Cálcio/Magnésio	Lonza	BE17-516F
L-Glutamina	Sigma	G7513
Penicilina/Estreptomicina	Sigma	P0781
2-Mercaptoetanol	Gibco	31350-010
ITS (Insulina-Transferrina-Selênio)	Gibco	51500-056
Solução de aminoácidos não essenciais	Sigma	M7145
Fer-In-Sol	Mead Johnson
Ferlixit	Aventis
Ácido Oleico	Sigma	01257-10 mg
Ácido Linoleico	Sigma	L5900-10 mg
Humano bFGF	Gibco	AA 10-155
Fatores de crescimento reduzidos Matrigel	Becton Dickinson	356230
Tripsina	Sigma	T3924
Heparina sódica	Mayne Pharma
Solução azul tripano	Sigma	T8154	PREJUDICIAL
Corante azul patenteado	Sigma	19, 821-8
EDTA	Sigma	E-4884
Paraformaldeído	TAAB	P001
Tamoxifeno	Sigma	T5648
Tamoxifeno 4-OH	Sigma	H7904
pLv-CMV-MyoD-ER(T)	Addgene	26809
Cardiotoxina	Sigma	C9759	PREJUDICIAL
Povidona iodo
Goma Tragachant	MP Biomedicals	104792
Isopenthane	VWR	24,872,323
Tecido Tecidual OCT	Sakura	4583
Sacarose	VWR	27,480,294
Corrediças de vidro polarizadas	Thermo	J1800AMNZ
Eosin Y	Sigma	E4382
Hematoxilina	Sigma	HHS32
Tricrômico	Bio-Optica	04-010802
Anticorpo de Cadeia Pesada de Miosina de Camundongo	DSHB	MF20
Anticorpo anti-lamin A/C de camundongo	Novocastra	NLC-LAM-A/C
Hoechst 33342	Sigma Fluka	B2261
Anticorpo anti laminina de coelho	Sigma	L9393
MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
Sutura antibacteriana adsorvível 4-0	Ethicon	vcp310h
Seringa de agulha 30 G	BD	324826
Esteira	Instrumento
Esteromicroscópio	Nikon	SMZ800
Microscópio invertido	Leica	DMIL LED
Unidade de isoflurano	Harvad Apparatus
Fibra óptica	Euromecs (Holanda)	EK1
Almofada de aquecimento	Vet Tech	C17A1
Bisturis	Swann-Morton	11REF050
Pinça cirúrgica	Fine Scientific Tools		5/45
Cauterizador de alta temperatura	Bovie Medical	AA01
MEDIA COMPOSITION
A composição do meio é detalhada abaixo. HIDEMs meio de crescimento: MegaCell Dulbecco's Modified Eagle Medium (MegaCell DMEM) 5% de soro fetal bovino (FBS) 2 mM de glutamina 0,1 mM de β-mercaptoetanol 1% de aminoácidos não essenciais 5 ng/ml de fator de crescimento de fibroblastos básicos humanos (bFGF) 100 UI ml de penicilina 100 mg/ml de estreptomicina Alternativamente, se alguns dos reagentes acima não estiverem disponíveis, os HIDEMs podem ser cultivados em: Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) 10% FBS 2 mM de glutamina 0,1 mM de β-mercaptoetanol 1% Aminoácidos não essenciais (NEAA) 1% ITS (insulina/transferrina/selênio) 5 ng/ml humano bFGF 100 UI ml de penicilina 100 mg/ml de estreptomicina 0,5 μ Ácidos M oleico e linoleico 1,5 μ M Fe2+ (Fer-In-Sol) 0.12 μ M Fe3+ (Ferlixit) Meio de crescimento MIDEMs: DMEM 20% FBS 2 mM de glutamina 5 ng/ml de bFGF 100 UI ml de penicilina 100 mg/ml de estreptomicina Meio de diferenciação: DMEM 2% Soro de cavalo (HS) 100 UI ml de penicilina 100 mg/ml de estreptomicina 2 mM de glutamina
Tabela 1. Lista de Reagentes, Materiais, Equipamentos e Meios.

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