One Minute, Sub-One-Watt Photothermal ablação tumoral Usando Porphysomes, Intrínseca Multifuncional nanovesículas

Resumo

Nós desenvolvemos novas nanovesículas multifuncionais intrínsecas chamados porphysomes, que têm dependentes de estrutura fluorescência auto-têmpera e propriedades fototérmicos únicas, assim funcionando agentes terapia fototérmica como potentes. Formulamos porphysomes utilizando extrusão de alta pressão e investigou sua eficácia terapia fototérmica em um modelo de tumor xenoenxerto.

Resumo

Recentemente, desenvolveu porphysomes como nanovesículas intrinsecamente multifuncionais. Um fotossensibilizador, pyropheophorbide α, foi conjugado com um fosfolípido e depois auto-montados para vesículas esféricas de lipossomas semelhante. Devido à altíssima densidade de porfirina na bicamada lipídica porfirina, porphysomes gerado grandes coeficientes de extinção, dependente da estrutura de fluorescência auto-extinção, e excelente eficácia fototérmica. Na nossa formulação, porphysomes foram sintetizados utilizando a extrusão de alta pressão, e mostrou um tamanho médio de partícula de cerca de 120 nm. Injecção de vinte e quatro horas após a intravenosa de porphysomes, a temperatura local do tumor aumentou de 30 ° C a 62 ° C rapidamente após a exposição de 750 mW (1,18 W / cm ^2), 671 nm, a irradiação com laser de um minuto. Após a ablação térmica completa do tumor, escaras formado e curado dentro de 2 semanas, enquanto que nos grupos de controlo, os tumores continuaram a crescer e todos atingiram o definido brponto d dentro de 3 semanas. Estes dados mostram como porphysomes pode ser utilizado como terapia fototérmica potente (PTT) agentes.

Introdução

Porphysomes são novos nanovesículas multifuncionais que, recentemente desenvolvidos, que são capazes de imagem e terapia multimodal ^1. Eles são formados por camadas duplas porfirina auto-montados e contêm uma altíssima densidade de porfirina (mais de 83, 000/porphysome partículas), o que gera grande coeficiente de extinção e resulta em única dependente de estrutura fluorescência auto-extinção. Porphysomes têm boas in vivo farmacocinéticas e de biodistribuição propriedades: eles exibem uma meia-vida no sangue de 12 horas após a administração sistemática, e passivamente acumulam em tumores de xenoenxerto com 7,5% ID / g às 24 h pós-injecção ^2.

Sua estrutura única e propriedades físico-químicas fazer porphysome um bom candidato para a imagem latente e terapia multimodal guiada por imagem. Primeiro de tudo, contendo porfirina, porphysomes são intrinsecamente adequado para imagens de fluorescência de tumores após a acumulação do tumor ^1.Além disso, cada porfirina tem um local estável de radioisótopos quelantes, por conseguinte, porphysomes pode ser facilmente marcada com radioisótopos, tais como 64Cu para imagiologia PET ^3. Além disso, a energia da luz absorvida é dissipada termicamente sob exposição a irradiação com laser quando porphysome estrutura está intacta, assim porphysomes também exibem imagens fotoacústica e capacidades únicas PTT. Demonstrou-se que 24 horas após a injecção intravenosa de porphysomes, irradiação com laser do tumor acumulou-porphysome induziu um rápido aumento de temperatura e de ablação do tumor fototérmica forte. Isto demonstrou que porphysomes são potenciadores fototérmicos eficientes com coeficiente tão alto como as nanopartículas de ouro (AuNPs) extinção ^1. Por outro lado, em comparação com outros agentes fototérmicos inorgânicos, incluindo AuNPs, porphysomes mostrar uma vantagem notável em biossegurança, devido à sua natureza orgânica. Porphysomes são enzimaticamente biodegradável e induzir toxicit aguda mínimay em ratos com doses intravenosas tão elevadas como 1000 mg / kg ^1. Além disso, semelhante a lipossomas, a grande núcleo aquoso de porphysomes pode ser passiva ou activamente carregados com agentes terapêuticos ou de imagiologia. As propriedades ópticas e de biocompatibilidade porphysomes demonstrar o potencial multimodal de nanopartículas orgânicas para imagiologia biofotônica e terapia.

Neste artigo, apresentamos o método de síntese de conjugados pyropheophorbide-lipídico, a fabricação eo método de caracterização de porphysomes utilizando extrusão de alta pressão. In vivo PTT em ratos é realizado, bem como para demonstrar a eficiência da habilitados para porphysome PTT no tumor tratamento utilizando um modelo de tumor de xenoenxerto subcutâneo.

Protocolo

1. Síntese de Pyropheophorbide-lípido

1. Combinar 200 mmol pyropheophorbide (preparado a partir de Spirulina Pacifica algas, tal como descrito anteriormente,... Zheng et al, Bioconj Chem, 2002, 13 -392) ^4, 98,7 mg 16:00 lysophophatidylcholine (1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero -3-fosfocolina, Avanti Polar Lipids # 855675), 76,3 mg de EDC, 48,7 mg de DMAP (4 - (dimetilamino) piridina) em 5 ml de amileno clorofórmio estabilizado por uma proporção de 1:1:2:2 Pyro: Lipid: EDC : DMPA.
2. Agita-se a mistura de reacção à temperatura ambiente sob árgon durante 24 horas. Evapora-se o clorofórmio sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo com aquecimento a 40 ° C. A mistura de isómeros pyro-lípido (piro ligados na posição sn-1 ou sn-2) é produzido.
3. Ressuspender mistura isómero piro-lípido em 1 mM de _CaCl2, 50 mM de Tris (pH 8), 0,5% de Triton X-100 e 10% de metanol numa concentração de 5 mg / ml. Adicionar fosfolipase A2 (PLA2) de mel de abelha veneno em0,1 mg / ml de concentração e incubar a solução a 37 ° C durante 24 h para digerir sn-1 piro-lípido e para produzir o sn-2 piro-lípido isómero puro.
4. Adicionar 2 volumes adicionais de clorofórmio e 1,25 volumes de metanol, extracto, e, em seguida, remover o solvente, utilizando evaporação rotativa a pressão reduzida a 40 ° C. Ressuspender o produto da clivagem em 1% de MeOH em DCM e purifica-se sobre uma pequena coluna de sílica diol para o isomericamente puro piro-lípido.

2. Preparação de Porphysomes

1. Dissolver pyropheophorbide-lipídico, distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-metoxi (polietileno glicol) (PEG-2000-PE) e colesterol em clorofórmio separadamente, e gravar as concentrações respectivamente.
2. Prepare porphysome filme lipídico em um tubo de ensaio de borosilicato mm de 12x75 com um peso total de lípido de 5 mg / tubo através da combinação de 65% molar de lípido-porfirina, 5% molar de PEG-2000-PE e 30% molar de colesterol.
3. Secam-se as películas de lípidos, sob uma corrente de nitrogás gen e deixá-los ainda mais seco sob vácuo por 1 hora. Armazenar as películas lipídicas, a -20 ° C sob atmosfera de árgon até a hidratação e extrusão futuro.
4. Adicionar 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS, NaCl 150 mM, fosfato 10 mM, pH 7,4) a cada tubo de filme lipídico. Congele o tubo de ensaio em azoto líquido até estar completamente congelada, e em seguida descongelar o tubo em 65 ° C num banho de água, até a amostra ter todos derretido. Vortex o tubo, para um total de 30 seg (3x com 10 seg cada, com 5 seg re-aquecimento a 65 ° C em banho de água entre cada vórtice).
5. Repetir o congelamento-descongelamento durante 5 ou mais ciclos de cima do necessário até que não há grandes agregados podem ser observados na solução hidratada. Deixe a suspensão porphysome no gelo quando terminar.
6. Montar o extrusor de alta pressão (10 ml) com dois filtros empilhados de 100 nm de policarbonato instalados dentro do extrusor Thermobarrel Ligação a um circulador termostatizado a 65 ° C num banho de circulação de água, e ligar o sistema de extrusão para um tanque de alta pressão por azotoCertifique-se de fornecimento.
7. Transferir a suspensão porphysome para a câmara de extrusão usando uma pipeta de transferência de 9 polegadas de vidro. Ajuste a pressão girando o botão no regulador tanque de nitrogênio até uma leitura entre 200 e 300 psig é observado como pressão inicial de extrusão. Abrir a válvula do regulador de pressão gradualmente até caudal porphysome suficiente é alcançado ou um máximo de 800 psig (5440 kPa) de pressão é alcançado.
8. Após o primeiro passo de extrusão está completa, fechar a válvula de controlo de pressão e libertar a pressão da extrusora com a abertura da válvula de alívio de pressão na parte superior da extrusora. Reencher a extrusora com a solução porphysome recém-extrudido, e repetir a extrusão de, pelo menos, 10 vezes, para assegurar que a solução final é extrudido homogéneo.
9. Determinar a concentração de solução final porphysome medindo a absorção de uma amostra diluída em metanol, por UV-Vis espectrómetro. Calcular a concentração usando a seguinte equação sagacidadeh o coeficiente de extinção de 97000 M ^-1 cm ^-1 a 410 nm para pyropheophorbide-lípido.

10. Meça o tamanho da distribuição final de porphysomes usando um Malvern Zetasizer ZS90 por espalhamento de luz dinâmico. Diluir solução porphysome em PBS e realizar três medições com 15 corridas cada, para a média dos resultados.
11. Determinar a extinção da fluorescência de porphysome por comparação da emissão de fluorescência de porphysome temperada (1 mM em PBS) e porphysome extinta (1 mM em 1% de Triton X-100) utilizando um espectrofluorímetro. Tomar os espectros de antes e depois do detergente (Tirton X-100) são adicionados, e a normalizar o sinal de leitura de fluorescência máxima. Defina a excitação de ser 410 nm, e faixa de comprimento de onda de emissão a ser 600-800 nm.
12. Manter solução porphysomes sob árgon a 4 ° C até uso futuro, e protegê-la da luz por alumínio fóleo.

3. Preparação de Animais Modelo de Xenoenxerto

1. Cultura das células KB em meio RPMI-1640 (com 10% de FBS), e manter as células em 5% de CO ₂ e atmosfera hidratada a 37 ° C.
2. Colheita de células KB, usando a técnica de cultura de células padrão. Manter a suspensão de células (20.000 células / ml) em tampão fosfato salino (PBS) em gelo durante o armazenamento a curto prazo até à altura da injecção.
3. Prepare um KB xenografts em camundongos nus. Os ratinhos nus são adquiridos em Charles River Laboratories, quando eles são de 20 g (Categoria # CRL: NU (NCr)-Foxn1 ^nu, 6-7 semanas de idade), dado dieta padrão e de cama (Harlan Laboratories; Dieta: irradiados LM-485, # 7912; cama: cama sabugo, ¼ ", # 7097). Esterilizar todas as ferramentas de manipulação de animais (seringas, fórceps, e almofada animal) antes de experimentos. Anestesiar ratos com isoflurano a 2% v / v em 100% de gás portador de oxigénio. Todos os protocolos de animais são aprovados pela instituição (Universidade Saúde NeTwork neste caso) cuidados com os animais e uso comitê.
4. Injectar células tumorais suspensas em PBS subcutaneamente para o flanco direito dos ratinhos. Ratos está pronto para ser utilizado depois de 10 dias, quando tumor atinge diâmetro de 4-5 mm e espessura de 2-3 mm.

4. In vivo Fototérmica Terapia

1. Injetar porphysomes (contendo 750 nmol pyro em volume de 200 mL) por via intravenosa, via veia da cauda. Conduzir a laser irradiação 24 horas pós-injeção de porphysomes.
2. Nesta seção, realizar todos os procedimentos em uma sala de segurança do laser fechado. Use óculos de segurança do laser durante a irradiação laser.
3. Configure o equipamento de irradiação laser. Segure a fibra de laser e um difusor por uma braçadeira em um carrinho. Defina a potência do laser em nível baixo e ligar o laser. Ajuste a altura da fibra de laser para conseguir uma área de irradiação de 9 mm de diâmetro (DPSS Laser, LaserGlow Technologies, Toronto, Canadá), calibrar a potência do laser de 750 mW (1,18 W / cm ²⁾ com apower metros e, em seguida, desligue o laser para preparar os animais.
4. Anestesiar os animais com isoflurano a 2% v / v em 100% gás de transporte de oxigênio pelo nariz cone nenhuma limpeza evidente de isoflurano um perigo risco para a saúde humana). Confirme se o animal é anestesiado profundo o suficiente através da realização de uma pitada do dedo do pé com uma pinça ou os dedos para as patas traseiras do animal. Os animais estão prontos para a irradiação do laser quando eles não respondem a este procedimento.
5. Monitorar a temperatura do tumor por uma câmera infravermelha térmica (Mikroshot, LUMASENSE Technologies). Coloque a câmera perto do tumor, focalizá-la bem e ter uma imagem de pré PTT, bem como uma imagem de luz branca normal antes do início da irradiação de PPF.
6. Ligue o laser novamente, e aumentar a potência de luz de 750 mW. Posicionar o tumor no centro do feixe de laser para se o tumor completamente coberta, e iniciar a temporização da irradiação. Pegue a imagem temperatura tumor a cada 5 segundos para um tratamento a laser de um minuto. Desligue a laser em 1 min. Stop o fornecimento de gás de 2% de isoflurano, espere até que o animal se recuperar da anestesia e colocá-lo de volta para a jaula.
7. Mantenha os ratos em normotermia biotério sob 0:12 hr ciclo claro e escuro de acordo com protocolos de animais aprovados pela University Health Network. Injetar buprenorfina (0,05 mg / kg, por via subcutânea, duas vezes por dia durante uma semana após a irradiação com laser para reduzir a dor causada pela cicatriz. Cada dois dias, a medir o diâmetro do tumor usando uma pinça e tirar uma foto. Calcule o volume do tumor usando o seguinte equação: V = π / 6 · a · b ^2, onde a é o diâmetro de comprimento, e b é o curto.
8. Sacrificar os animais colocando-os na câmara de CO _2, quando o longo diâmetro do tumor atingir 10 mm, uma vez que é o ponto final definido em nosso laboratório. Realizar luxação cervical após o tratamento com CO2. Traçar a curva de sobrevivência.

Resultados

Pyropheophorbide é conjugado com o fosfolípido, como um monómero de lípidos estáveis ​​(Figura 1A) e a conjugados de auto-reunir-se para formar porphysomes pelo método de extrusão de membrana utilizando uma extrusora de alta pressão. Geralmente é difícil para expulsar suspensão porphysome-lipídico durante os 3 primeiros ciclos de extrusão, com taxa de fluxo relativamente lento. Quanto mais as extrusões são repetidos, a taxa de fluxo da solução extrudido aumenta gradualmente, e a pressão pode ser ligeira...

Discussão

No desenvolvimento de tecnologias de entrega de drogas, nanopartículas multifuncionais são actualmente sob investigação largas para controle preciso do veículo de distribuição de drogas enquanto mantém uma carga de droga elevada. Lipossomas carregados de porfirina têm sido desenvolvidos para obter melhores propriedades farmacocinéticas e de entrega mais eficaz do que a administração directa de porfirina, mas existem obstáculos, incluindo a quantidade de carga restringida de porfirina e redistribuição rápida de porfirina...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Evaporador rotativo	Thermo-Savant	SPD131DDA
Votex	Scientific Industries	SI-0236	Número do modelo: G560
Extrusora de alta pressão	LIPEX, Northern Lipids Inc.	T.001	Extrusora Thermobarrel de 10 ml
Termostatos termostatizados (termostatista)	Thermo SCIENTIFIC	SC100-S5P
Filtros de policarbonato	Avanti Polar Lipids	610005	Tamanho dos poros 100 nm e diâmetro da membrana 19 mm
Zetasizer	Malvern Instruments	ZS90
UV/Visible Spectrophototmeter	Varian Austrália	Cary 50 Bio UV/Espectrofotômetro
Espectrofluorômetro	HORIBA Scientific	FluoroMax-4
Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)	Hitachi	H-7000
Incubadora de cultura de células	SANYO	MCO-18AIC
Powermeter	Thorlabs	PM100D	com sensor S142C
671nm Laser	LaserGlow Technologies	LRS-0671_PFN-02000-05	S/N:10097270
Termômetro infravermelho	Mikroshot, LUMASENSE Technologies	9102409
Óculos de proteção a laser	LaserGlow Technologies	AGF6602XX	Densidade óptica: 1,5+ a 630-700 nm

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