Summary
Vi beskriver dissektion av nervsystemet av den marina sjöhare
Abstract
Den marina gastropod mollusk Aplysia californica har en ärevördig historia som en modell för nervsystemets funktion, med särskild betydelse i studier av inlärning och minne. De typiska förberedelser för sådana studier är sådana där sensoriska och motoneurons finns kvar intakt i ett minimalt dissekerade djur, eller ett tekniskt genomarbetade neuronal samodling av individuella sensoriska och motoneurons. Mindre vanligt är det isolerade neuronala förberedelser där små kluster av nominellt homogena nervceller är dissocierade i enskilda celler i kortsiktig kultur. Sådana isolerade celler är användbara för den biofysiska karakterisering av jonströmmar med hjälp av tekniker patch clamp, och riktad modulering av dessa konduktanser. Ett protokoll för framställning av sådana kulturer beskrivs. Protokollet utnyttjar de lätt identifierbara glutamaterg sensoriska nervceller i pleura och buckala ganglierna, och beskriver deras dissociation och minimalt underhåll in kultur i flera dagar utan serum.
Introduction
Den marina opistobranch mollusk, Aplysia, har varit en nyttig neurobiologisk modell för många decennier. Det är mest känd som en modell för tillvänjning och klassisk betingning 7, 8. Studier om lärande och minne i denna modell fick Nobelpriset i fysiologi eller medicin år 2000 för Eric R. Kandel, i ett pris han delade med Arvid Carlsson och Paul Greengard 10. Studier som omfattar elektriska inspelningar från reducerade preparat, i vilka delar av nervsystemet hos denna ryggradslösa dissekeras från djuret med nerver och muskler lämnas kvar, har hjälpt belysa betydelsen av enskilda nervceller i Aplysia. Identifiering av exakta molekylära mekanismer som utgör lärande i Aplysia dock ofta används en annan teknik, långsiktig samodlingar av en sensorisk neuron och en motoneuron, erhålls en efter en från enskilda givare djur och får bilda en synaps i kulturen skålen 21 .
Vi och andra 1, 3, 6, 14, 15, har 16 exploaterade den lätthet med vilken identifierade nervceller kan bli aktuella i denna modell samt deras uthållighet i långtidsförsök att göra dissocierade kortsiktiga kulturer av kluster av nominellt homogena neuroner där vi studerar jonströmmar under spänning klämma i patch clamp konfiguration. Många Aplysia nervceller stå upp till upprepade rundor av plåster fastspänning för att ge tid för långvariga experimentella manipulationer. Tekniken är användbar för nervceller såsom cellerna neurosecretory påse buken ganglion, och de sensoriska nervceller i pleura och buckala ganglierna vars dissociation vi beskriver här, men inte för mycket stora nervceller> 60 um diameter, såsom L7 eller R2 av buken ganglion. Vi anställer inte Aplysia serum i våra kulturer, till skillnad från de sensoriska-motoneuron samkulturer beskrivs på annat håll. De flesta nervceller som erhållits med hjälp av detta förfarande kommer att vara utan processer för than först 48 timmar i kultur, underlättar hela inspelningen cellspänning, men kommer sedan att gro och utveckla axoner och andra processer för cirka 14 dagar innan de dör av brist på näringsämnen och / eller tillväxtfaktorer.
Denna teknik ger primära kulturer av 50-100 neuroner per fat från fysiologiskt dokumenterade regioner i buckala och pleura ganglierna. Detta protokoll är användbart för forskare att studera aspekter av en enda cell physiology i experiment som kräver många experimentella replikat per djur. Den producerar ett matchat par av kulturer på grund av den anatomiska separering av målcellema i en vänster och höger hemiganglia, vilket medger studier som gynnas av matchade behandling och kulturer kontrollfunktioner.
Protokollet riktar buccala S cluster (BSC) neuroner i buckala ganglion, och pleura ventrocaudal (PVC) neuroner i pleura ganglion. Dessa celler är en lämplig storlek för hela inspelningar cellspänning och Robus displayt glutamaterga svar. Den diskuterade metoden är lämplig för de flesta ganglierna i Aplysia nervsystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Cellberedning
- Dag 1, väga och söva djuret.
- Väg en 30 g-1 kg djur. Söva i 5-10 djur volymer 01:01 havsvatten: isoton MgCl. 6H 2 0 under 1 h med luftning, såsom en elektrisk akvarium luftpump med bifogade airstone.
- Förbered dissektion leveranser.
- Montera ren dissektion bricka med rostfria raka stift, såsom tyg stift. Montera flera Petri-skålar innehållande artificiellt havsvatten (ASW, se tabellerna 1 och 3) + penicillin / streptomycin (P / S).
- Ha en låg effekt mikroskop. Ha rena dissektionsinstrument redo, t.ex. räfflade näsa och fin kirurgisk tång, och fina och stora kirurgiska saxar. Spraya instrumenten med 70% isopropylalkohol före användning och låt torka.
- Placera djuret på dissekering bricka.
- Position djur ventrala sidan nedåt i dissektion facket. Pin djurgenom kanterna på kroppen väggen och parapodial gränser, men undvik svans och huvud, för att exponera den dorsala ytan och underlivet spåret
- Skölj den dorsala ytan i slow-running kallt kranvatten. Applicera en lätt ström av 70% isopropylalkohol från en klämflaska längs underlivet spåret och över toppen av huvudet.
- Gör den första snittet.
- Med hjälp av en låg effekt mikroskop (se tabell 2) och reflekterat ljus för att observera den punkt där det genitala spåret härstammar från det främre skalet marginal, spänt hålla med ribbad-näsa pincett en vikning av vävnad till vänster om detta ursprung, medan snipping ett grunt hål hela vägen genom den jämn, slät yta på kroppsväggen precis till höger om den genitala groove med fina vinklade sax.
- Hemolymph bör observeras att hälla ur hålet, ibland bär med sig buken ganglion och mage.
- Expandera snittet.
- Använd stora saxar för att expandera the snitt anteriort till en punkt mellan rhinophores, att samtidigt som du drar uppåt med den undre kniven undvika nicking tarmen. De inre organen ska observeras att spilla ut av snittet.
- Avlägsna ganglierna.
- Flytta facket och fokusera mikroskopet på huvudet regionen.
- Använda rena pincett och fina saxar, ta bort huvudet ganglierna genom att bryta vid ett tillfälle de nerver som bildar huvudet ganglierna i en ring runt matstrupen för att ta bort pleura-pedal och cerebral ganglier som en grupp.
- Avlägsna den buckala ganglion som fäster på den ventrala sidan av matstrupen.
- Avlägsna buken ganglion genom att skära de 4 stora nerv konnektiv som utfärdar från denna ganglion.
- Isolera ganglierna av intresse.
- Trim huvud ganglierna isär och lämnar en längd av konnektiv bifogas varje ganglion av intresse som är lika med åtminstone diametern på ganglion, vilket kommer att fördröja enzym over-digereringav cellerna av intresse i nästa steg.
- Lägg varje mål ganglion genom 2 sköljningar av ASW + P / S, rör sig mellan sköljningar med ren pincett.
- Om inriktning på PVC-celler, lämna den högra lungsäcken hemiganglion fäst den högra pedalen hemiganglion, och på liknande sätt lämna vänster pleura hemiganglion fäst den vänstra pedalen hemiganglion.
- Bort oönskad ganglierna och resten av djuret enligt vedertagen forskning praktik.
- Enzymatiskt smälta ganglierna.
- För varje ganglion, förbereda en ml enzymlösning bestående av 3,75 mg dispas, 1 mg hyaluronidas och 0,3 g kollagenas typ XI per ml ASW + P / S i en 15 ml polypropylen koniska rör.
- Placera sköljas ganglierna i enzymlösning och fäst ordentligt locket. Placera röret på sidan på en rotationsskak (se tabell 2) vid låg hastighet under 13 till 5 h över natten vid cirka 23 ° C (rumstemperatur).
- Förberedodlingsskålarna.
- Innan microdissection (Dag 2), förbereda poly-D-lysin (PDL)-belagda odlingsplattor i en vävnadsodling huva. Lägg ~ 0,5 ml PDL (0,2 mg / ml sterilt vatten) till mitten av en 35 mm skålen för ~ 25 min.
- Skölj PDL 3x med sterilt vatten. Låt torka. UV-sterilisera plattorna.
- Dag 2 Isolera neuroner.
- Fyll mitten av 35 mm rätter som var PDL-belagda och UV steriliseras med ca 0,5 ml ASW + P / S för att skapa en ö av media inuti annars torra skålen. Detta kan göras på bänken, utanför vävnadsodling huva. En maträtt bör utarbetas för varje cell kluster som härrör från en hemiganglion.
- Ha en 100 mm skål diameter dissektion gjord av sylgard-beläggning och härdning av en 5 mm djup dissektion yta, utrustad med fina dissektion stift av flera storlekar som kan användas som nålar och sonder (se tabell 3). Skölj denna maträtt med 70% isopropylalkohol, sedan med ASW + P / S, och slutligen fill det med ASW + P / S.
- Förbered Microdissection rötas ganglier.
- Häll enzymet lösningen innehållande smält pleura-pedal och buckala ganglierna i dissektion skålen.
- Placera skålen på scenen av mikroskopet mot en svart yta under reflekterat ljus.
- Använda bifogade bindväv, stift ner varje pleura-pedal sidan hemiganglion rygg upp. Vävnaderna blir mjuk och intoleranta av sträckning.
- Microdissect PVC neuroner.
- Använda 2 par av rena fina tång, och hålla ett fint dissektion nål i en pincett som en sond, isolera PVC-celler från en pleura hemiganglion. Enzym matsmältning kommer att ha tagit bort eller brytas isär bindvävshinnan som täcker den PVC klustret ännu cellerna kommer att vidhäfta till varandra.
- Använd sonden för att lossa dessa celler från pedalen-pleura bindväv 18, låt cellen kluster faller till botten av dissektionskålen.
- Överför nervceller till kultur maträtt.
- Överför cellen klustret till en preparerad 35 mm kultur maträtt genom att försiktigt suga upp klustret i spetsen av en något brand polerat engångsglas Pasteur pipett, sedan fördela det långsamt i media ön i en kultur maträtt, var noga med att undvika att införa luftbubblor in i pipetten. Upprepa isolering av PVC kluster av andra hemiganglion och placera i en separat kultur maträtt.
- Microdissect och överför BSC nervceller.
- Nåla ut buckala ganglion ventrala sidan uppåt, med omsorg för att skona cellerna av intresse. Upprepa steg 1,12 med 2 BSC cellkluster av buckala ganglion 10.
- Isolering av PVC och BSC nervceller kommer att producera 4 odlingsskålar innehållande neuron kluster: 2 rätter innehållande BSC kluster och 2 rätter som innehåller PVC kluster. Släng resten av ganglierna och upphäva den 100 fat mm dissektion.
- DissocIATE cellen kluster.
- Placera en kultur maträtt som innehåller celler på scenen av låg effekt mikroskop och ta bort locket.
- Dissociera PVC klustret genom att försiktigt vicka botten av kulturen skålen intill cellkluster med en fin dissektion stift hålls i pincett. Fladdra gräver spetsen på stiftet i plasten i botten av skålen som om försöker att gräva ut en fleck av plast. När friktionen med plasten släpper pin punkt, är ett slagverk våg produceras genom mediet som bryter sönder den närliggande klump av celler.
- 5-10 flicks kan behövas för att nästan fullständigt dissociera cellerna, men det är bättre att lämna små kluster av celler i stället för till flick för mycket så att inte cellerna förstöras genom mekanisk ren.
- Sätt tillbaka locket och upprepa med andra kultur rätter.
- Lagra cellkulturer.
- Placera odlingsskålama innehållande media öar i deras centra med dissocierade celler tillen stor behållare som tillåter luftcirkulation, såsom en 150 x 25 mm rund plast petriskål, och placera denna maträtt i en inkubator inställd på 17 ° C.
- Installera i kammaren en öppen skål med vatten som en källa till fukt. Lämna ostörd över natten. Cellerna kommer att vidhäfta till poly-D-lysin beläggning i centrum av skålen.
- Flood odlingsskålarna.
- Dag 3, försiktigt översvämma rätter med 2,5 ml ASW + P / S. Granska och räkna cellerna med användning av ett inverterat mikroskop cellkultur. Store i 17 ° C inkubator.
2. Elektrofysiologi
Metoden är standard patch fastspänning som har beskrivits i talrika texter (t.ex. Sakmann och Neher, 1995) 16. Detta protokoll kommer att arbeta med celler ≤ 100 pF kapacitans, eller celler <60 um diameter under dag 3 och 4 i protokollet. Celler utan processer är optimala för inspelning. Följande särskilda consideratjoner gälla:
- Större celler kan rymmas med konfigurationsinställningen på Axopatch 200B förstärkare inställd på β = 0,1. Aktivering av mycket stora strömmar kan orsaka celler att fly spänningsklämma. ASW lösningar ersätta salt innehåll (t.ex. en bråkdel av NaCl substituerad med ogenomtränglig N-metyl-D-glukamin-klorid) kan användas för att minska helcell strömamplituden.
- Fiberfyllda borosilikat patch pipetter drog på en pipett avdragare och återfylls halvvägs med intracellulära lösning (ICS) som består av 450 mM KCl och andra salter (se tabell 1) är lämpliga, och borde ha motstånd på ca 0,5-1 MOhms. Om isolering av specifika jonströmmar önskas, till exempel, + Na strömmar i frånvaro av K strömmar, K + i denna lösning kan ersättas med andra joner, såsom Cs +. Cl - byte av ICS med ett ogenomträngligt anjon är också motiverad om en mer naturlig ICS önskas9.
- Cellerna är robusta med> 1 hr-långa inspelningar möjliga vid rumstemperatur. Inspelningen är optimalt på dag 3 och 4 i protokollet, vilket motsvarar 24-48 timmar i kultur. Efter 48 timmar finns det svårigheter att bilda gigaohm sälar, kanske på grund av utarbetandet av en glycocalyx på cellytan, och utrymmesproblem klämma orsakas av processen utväxt. Cellerna är användbara, men för icke-patch clamp studier, t.ex. toxikologi, som kan fyllas i <14 d..
- ASW och andra lösningar som skall matas från gravitationsmatade lösning enhet, samt intracellulär lösning, bör filtreras genom en spruta-monterad 0,2 filter ìm Acrodisk (tabell 3) för att eliminera fina partiklar som stör gigaohm tätning bildas.
- Desensibilisering sker vid användning av agonister såsom D-aspartat (D-Asp), därför ~ 1-2 min mellan tillämpningar av agonister rekommenderas. Omvänt är potentiering observeras ofta med snabb upprepad ansökankatjon av agonister såsom L-glutamat (L-Glu).
- Agonist aktiverade strömmar såsom L-Glu kan studeras genom att tillämpa agonister med Picospritzer pipett. Denna pipetten dras samma som plåstret pipetten och innehåller agonist i ASW. När spetsen av denna pipett är placerad under utloppsröret av allvaret matade lösning enhet, och vid en 45 ° vinkel från utloppsröret (figur 2F), kommer agonisten att snabbt tvättas bort från cellen, och desensibilisering kommer att minimeras. Den agonist pipett bör skapa en vinkel på 90 ° eller mer i förhållande till plåstret pipetten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Platserna för de sensoriska neuroner inom ganglierna som är riktade i detta protokoll, är BSC och PVC nervceller som visas i figur 1. BSC nervceller ligger i 2 symmetriska ovala kluster på den ventrala sidan av buckala ganglion, den yta som är vänd bort från den buckala massan i intakt ganglion (Figur 1A). De PVC-neuroner bildar bilaterala, V-formade kluster som lindas runt den dorsala ytan av pleural ganglion mot mittaxeln (Figur 1B). Dessa sensoriska neuroner har fördelen av en stereotyp lokalisering inom ganglier, även om den högra eller vänstra kluster saknas hos enskilda djur hos ca 1% av händelser. BSC och PVC neuron kluster kan identifieras genom den mörka orange färg av cellmembranet och relativt små jämfört med närliggande celler, som visas i den stora cirkeln konturerna av figur 1A.
I kultur, dessanervceller är ofta utan processer dagen efter plätering (Figur 2A) och är idealiska för patch fastspänning den dagen, och en dag senare. Det är ibland möjligt att åstadkomma tillräckligt utrymme klämma även när cellerna verkar ha processen utväxt (Figur 2F), vilket tyder på att inte alla gro som verkar härröra från cellen kroppen är en del av cellen. Om hanteringen efter enzymatisk spjälkning har varit mild, celler anländer i kultur med vissa processer intakta, och dessa processer växa med tiden (Fig. 2B-2E). Sådana celler är inte lämpliga för patch fastspänning men intracellulära inspelning är möjlig.
Hela cell patch clamp strömmar bärs av spänningen gated Na + och Ca2 + lätt registreras från PVC och BSC neuroner i kortsiktig kultur 6, och båda celltyperna visar en blandad K ström. BSC neuroner reagerar också på acetylkolin, serotonin och NMDA 4 (figur 3C) Med excitatoriska strömmar, medan både BSC och PVC neuroner svarar på L-Glu och D-Asp 3 (figurerna 3A och 3B) med excitatoriska strömmar. De farmakologiska egenskaperna hos L-Glu-och D-Asp-inducerade strömmar i dessa neuroner har beskrivits 4.
Figur 1. Mikrofotografier visar läget för de glutamaterga sensoriska nervceller i buckala och pleura ganglierna (röda cirklar). A. buccala S cluster (BSC) neuroner, identifierbara genom sin mörka orange färg (stor cirkel på vänster hemiganglion) och motsvarande position i höger hemiganglion (mindre cirklar). B. V-formade, mörkorange pleural ventrocaudal (PVC) cell kluster av den högra pleural hemiganglion (vänster hemiganglion ej visad).
Figur 2. Mikrofotografier av glutamaterg sensoriska neuroner i odling A. celler från PVC klustret 24 h efter plätering i kultur skålen visar 2 sensoriska nervceller och andra celler,. Övriga PVC-celler från olika kulturer vid 24 tim visas som inläggningar B, C.. En BSC neuron i odling vid 24 h och samma neuron vid 96 h, resp. D, E. A PVC neuron i odling vid 24 h och samma neuron vid 96 h, resp. F. A PVC neuron vid 48 tim i en patch clamp-experiment. Plåstret pipett bringa cellen från den högra kanten, medan Picospritzer pipetten är i botten. Den stora mörka skugga syns till vänster om cellen är öppnandet av det strömmande badet pipett. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3. Glutamaterga strömmar i hela klämma cell patch inspelningar från BSC och PVC nervceller. A. Whole cell ström i en BSC neuron till följd av påtryckningar tillämpning av L-Glu (1 mM, 100 ms). B. hel cell ström i en PVC-neuron i påtryckningar tillämpning av D-Asp (1 mM, 100 ms). C. Hel cell NMDA ström i samma BSC cell som i A (1 mM, 100 ms).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dissociation teknikerna som beskrivs här ger sensoriska neuron kulturer innehållande 50-100 isolerade nervceller varvas med små mängder glia och andra oidentifierade celler. De mest kritiska stegen i protokollet är den tid det ganglierna förblir i enzymlösning och snärta, dissociation av de spjälkade cellkluster att bryta isär klustret i enskilda celler. Enzymdigestion (steg 1,8) måste optimeras på tillgängliga temperatur. Vid 23 ° C med långsam skakning, är 13 hr tillräcklig för rötning av BSC kluster while15 hr är optimal för PVC-kluster. Låga cellutbyten i kulturen skålen kan hänföras till otillräcklig tid i enzym, eller för mycket mekanisk sönderdelning under antingen cellöverföring steget (1.11 och 1.12) eller under snärta steget (1,13). Misslyckande av cellerna att klibba ner till odlingssubstratet, liksom kortvarig överlevnad i odling är vanligtvis på grund av för mycket mekanisk sönderdelning. Förorening av culrer kan också förekomma, och är bäst hanteras genom att säkerställa att den sövda djuret väl sköljs, att dissektionsinstrument är rena, och att ganglierna av intresse sätts genom flera sköljningar i ASW + P / S. Det kan vara nödvändigt att tvätta och alkohol-ren instrument mellan olika delar av dissektion förfarandet, eller har tillräckliga instrument redo så att rena dem kan användas för varje steg.
Aplysia neurobiologiska studier är oftast utförs på reducerade preparat som bevarar nerv kopplingar mellan nervceller eller mellan nervceller och muskler 2, 18. Dessa preparat underlättar överlåtelse av kontrollen av muskulösa processer till specifika nervceller och neuronala kretsar och även möjliggöra studier av potentiering och underlättande av repetitiva reflexer. Intakt preparat är inte lämpade för vissa typer av spänningsklämma protokoll och studien av effekterna av agonister som snabbt desensitize deras receptorer.
Den långsiktiga neuronal co-kultur är ytterligare ett verktyg för att studera potentiering och underlättande under mycket kontrollerade förhållanden. Långsiktiga samkulturer också lämpar sig för biokemiska studier på enstaka nervceller. Framgång för co-kultur preparatet tillskrivs ofta tillsats av upp till 50% Aplysia hemolymph till kulturer 17. Men beror framgången för denna strategi ofta på batch-till-batch variation av denna hemolymph.
Den dissocierade cellkultur framställning beskriven här utökar användningen repertoar Aplysia modellen. Dissocierade cellkulturer är inte lämpliga för att härleda nervbanor eller studera intakta synaps som ovan nämnda metoder gör. Den dissocierade cellodling beredning har sin största nytta för att bekräfta förekomsten av specifika joniska konduktanser och deras kinetiska och farmakologiska egenskaper i enkla klämma cellspänning experiment. Sevrala unika strömmar har upptäckts med hjälp av en enda cell beredningar, inklusive en excitatorisk katjon ström i påse celler 19 och den D-Asp receptorström i BSC nervceller 4. Studier på Aplysia fokuserar sällan på jonströmmar enskilda celler, delvis på grund av den ofta otympliga storleken av sådana celler och förekomsten av många andra lämpliga typer modell cell som lämpar sig väl för att patch clamp teknik. Som ett resultat, är det föreligger vissa strömmar i Aplysia, såsom de som aktiveras av alfa-amino-3-hydroxyl-5-metyl-4-isoxazol-propionsyra (AMPA) vanligen härledas från block av förmodad AMPA-receptorn (R) -relaterade beteenden från Ampar antagonister som tillämpas på den reducerade nerv förberedelser, snarare än direkt registreras. Således kontroll av förekomsten av vissa strömningar saknas. Isolering av odlade glutamaterga neuroner och enda cell spänningsklämma metodik ger ett direkt prov för existensen avolika typer av L-Glur kanaler i denna modell organism.
En annan användning av Aplysia neuroner i enstaka klämma cell patch experiment är i dissekera second messenger kaskader. Aplysia nervceller är särskilt väl lämpade för studier av andra budbärare inducerad modulering eftersom de är stabila under långa perioder av inspelningen vid rumstemperatur 3, 12, 20, 21 , och är tillräckligt robust att enskilda celler kan sparas efter inspelningen och registreras från igen efter 24 timmar 5. Dessa buckala och pleura sensoriska neuron kluster ger lämpligen ett par matchande kulturer från varje ganglion, så att en maträtt kan betecknas en kontroll kulturen samtidigt sin kompis får en behandling.
En ytterligare fördel med denna beredning är i studier av den morfologiska status för enskilda neuroner. Exempelvis upptäckte vi att cellkroppar Aplysia neuroner från senescent djur var LARGer än de från yngre djur, men inte utarbeta cellprocesser efter flera dagar i kultur 6. Dessa isolerade neuron förberedelser underlättar också studier med vitala färgämnen för att bedöma nivåerna av intracellulärt Ca +2, pH, reaktiva syreradikaler, mitokondriell membranpotential och andra fysiologiska egenskaper som sedan kan jämföras med neurofysiologiska funktioner i enskilda celler. Medan vissa av dessa metoder är tillämpliga i intakta eller co-kultur preparat, är datainsamling mycket enklare att använda isolerade nervceller i detta enkla odlingssystem. I framtiden hoppas vi kunna använda dessa celler för enskild cell molekylär profilering 13.
Den dissocierade kortsiktiga kultur ger idealiskt material för att undersöka grundläggande neurofysiologiska processer, och kan ge ett särskilt kraftfullt verktyg när det används i kombination med studier minskad involverar eller co-kultur preparat. Den dissocieradeAplysia neuron kultur utökar användbarheten av denna ärevördiga djurmodell för nya och intressanta områden i neurovetenskap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Finansierat av NIH P40 OD010952, den Korein Foundation, en University of Miami Fellowship till SLC och en Maytag gemenskap till ATK. Författarna erkänner tacksamt personalen vid Nationellt resurscentrum för Aplysia, liksom Lauren Simonitis och Hannah Peck, som tillhandahålls micrographs för en siffra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID - | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator | |||
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment. |
|||
References
- Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).
- Carlson, S. L., Fieber, L. A. Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).
- Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).
- Fieber, L. A. Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica. J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).
- Fieber, L. .A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging. Br. Res. 1343, 28-36 (2010).
- Glansman, D. L. Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).
- Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation. Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).
- Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia. Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).
- Kandel, E. R. Cellular basis of behavior. , W.H. Freeman. New York. (1976).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).
- Magoski, N. S. Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase. J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).
- R, E. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
- Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).
- Single-channel recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. NY. (1995).
- Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons. J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).
- Schacher, S., Proshansky, E. Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment. J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).
- Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).
- Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons. J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).
- White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).
- Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).
