Exame do Synaptic Vesicle Reciclagem Usando FM Corantes Durante Evocado, espontânea, e as atividades de Synaptic miniatura

Resumo

Descreve-se o uso de corantes estiril FM imagem sináptica reciclagem vesícula nos terminais nervosos funcionais. Este protocolo pode ser aplicado não só a evocada, mas também espontânea e actividades sinápticas em miniatura. O protocolo expande a variedade de eventos sinápticos que podem ser eficazmente analisados.

Resumo

Vesículas sinápticas em terminações nervosas funcionais sofrem exocitose e endocitose. Esta reciclagem das vesículas sinápticas pode ser efetivamente analisados ​​usando corantes estiril FM, que revelam turnover da membrana. Protocolos convencionais para o uso de corantes FM foram concebidos para a análise de neurônios seguinte estimulada (evocado) atividade sináptica. Recentemente, protocolos tornaram-se disponíveis para a análise dos sinais de FM que acompanham as atividades sinápticas mais fracos, como eventos sinápticas espontâneas ou em miniatura. A análise destas pequenas alterações nos sinais de FM requer que o sistema de imagem é suficientemente sensível para detectar pequenas alterações na intensidade, ainda que as mudanças de artefatuais de grande amplitude são suprimidas. Aqui, descrevemos um protocolo que pode ser aplicado a evocado, espontânea, e actividades sinápticas em miniatura, e usar os neurónios do hipocampo em cultura como um exemplo. Este protocolo inclui também um meio de avaliar a taxa de fotobranqueamento de corantes FM, como este é um significativofonte de artefactos quando imagens pequenas alterações em intensidade.

Introdução

A funcionalidade das vesículas sinápticas é um importante determinante da transmissão sináptica. Essas vesículas libertar neurotransmissores quando se fundem com a membrana plasmática pré-sináptica (exocitose), e tornam-se pronto para um outro ciclo de libertação depois de ser regenerada a partir da membrana plasmática (endocitose) e recarregado com neurotransmissor. A investigação sobre a dinâmica dos mecanismos subjacentes e reciclagem das vesículas sinápticas foi muito acelerado pela introdução de corantes estiril FM ^1. Estas moléculas anfipáticas, que têm carga positiva grupos de cabeça hidrófilos e caudas hidrofóbicas (vários corantes na Figur....

Protocolo

1. Cultura primária de neurônios do cérebro dos mamíferos

Todos os procedimentos com animais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê da Universidade de Iowa Institutional Animal Care e Use.

1. Prepare a cultura de células dissociadas de regiões CA3-CA1 do hipocampo de ratos ou ratazanas, nos dias pós-natal 0-1 ^19,20. Placa as células do hipocampo em lamelas de 12 mm de espessura (número 0) pré-carregados com a camada alimentadora de células gliais de rato, em placas de 24 poços, e a uma densidade de 12.000 células / poço.
2. Cultura dos neurônios do hipocampo para pelo menos 8 dias para terminais nerv....

Resultados

Como um exemplo, mostramos resultados representativos para o curso de tempo da descoloração das vesículas sinápticas (Figura 4). Neurónios do hipocampo em cultura foram coradas com FM4-64 utilizando a actividade sináptica espontânea (passo 2.3) e lavou-se com solução livre de corante (solução 2 enxaguamento). A imagem mostra o curso inicial de tempo de descoloração usando atividade espontânea (passo 5.3) (parte inicial da linha contínua, a Figura 4A). Isto é seguido por o curso de tempo.......

Discussão

Descrevemos os protocolos de coloração e descoloração vesículas sinápticas em resposta a evocada, atividade sináptica espontânea e miniatura, e para geração de imagens durante a fase de descoloração. Em adição aos protocolos existentes, que têm incluído um novo protocolo de observar a descoloração FM com base na actividade sináptica em miniatura. Usando estes protocolos, que anteriormente identificado anormalidades nos neurônios cultivados a partir de um modelo do rato da distonia distúrbio de movimento. Na comparação c.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Gerador de pulsos	AMPI	Master-8
Estimulador isolado	Digitimer	DS3
Microscópio invertido	Nikon	Eclipse TS100	Este é usado para avaliar a morfologia celular em baixa ampliação.
Microscópio invertido	Nikon	Eclipse TiE	Este é usado para imagens de fluorescência e luz transmitida de alta resolução, com mínima deriva de foco.
Lente objetiva	Nikon		Recomenda-se uma lente de imersão em água. Uma lente de imersão em óleo pode ser usada, exceto quando a estrutura imageada estiver profunda em relação à superfície da lamínula (por exemplo >10 μm).
Cubo de filtro	Nikon	77032509	490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em para FM1-43
Cubo de filtro	Nikon	77032809	490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em para FM4-64.
Câmera EMCCD	Andor Technology	iXon EM+ DU-860	Esta câmera EMCCD é usada para detecção de fluorescência de alta sensibilidade.
Chiller de recirculação líquida	Solid State Cooling Systems	Oasis 160	Este é usado para perfusão contínua da câmera com água refrigerada, mantendo uma temperatura de -80°C, reduzindo assim o ruído.
LED	CoolLED-Custom Interconnect	490 nm	Esta fonte de luz é usada para controle rápido de ligar/desligar da excitação de fluorescência.
Software de aquisição de imagens	Andor Technology	Solis
Câmara de imagem	Warner Instruments	RC-21BRFS
Sistema de perfusão rápida	Warner Instruments	SF-77B
CNQX	Tocris Bioscience	1045
D,L-AP5	Tocris Bioscience	0106
Tetrodotoxina	Tocris Bioscience	1069	Atenção: reagente tóxico. Manipular com cuidado.
FM1-43	Invitrogen	T35356
FM1-43 fixável por aldeído (FM1-43FX)	Invitrogen	F35355
FM4-64	Invitrogen	T13320
FM4-64 fixável por aldeído (FM4-64FX)	Invitrogen	F34653
Ionomicina	Sigma-Aldrich	I0634
Solução salina equilibrada de Hanks’	Sigma-Aldrich	H2387
Mínimo Meio Essencial	Invitrogen	51200-038	Esta solução não contém vermelho de fenol, que interferiria na imagem de fluorescência.
Paraformaldeído	Electron Microscopy Sciences	15710	Atenção: reagente tóxico. Manipular com cuidado.
Sacarose	Sigma-Aldrich	S7903