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A morte celular associada com mitose anormal observado por imagem confocal em células vivas Câncer

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DOI:

10.3791/50568

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21 de agosto de 2013

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1Cancer Research Center, Sheba Medical Center, 2The Neufeld Cardiac Research Institute, Tel-Aviv University, 3Department of Physiology and Pharmacology, Tel-Aviv University, 4Imaging Unit, Sackler Faculty of Medicine, Tel-Aviv University, 5Biotechnology and Cell Signaling, Ecole Superieure de Biotechnologie Strasbourg, 6Department of Human Molecular Genetics and Biochemistry, Tel-Aviv University

Neste artigo

Resumo

A actividade citotóxica do fenantridina PJ-34 em células de cancro sujeitos a mitose foi documentada em tempo real por meio de imagem confocal vivo. PJ-34 erradicou o câncer de mama humano MDA-MB-231 células abrigam extra-centrossomas na mitose. Ao contrário de mitose bi-focal normal, o Extra-centrossomas não foram agrupados nos dois pólos do fuso na presença de PJ-34.

Resumo

Derivados fenantreno que actuam como inibidores potentes PARP1 impedido o agrupamento bi-focal de centrossomas excedentários em células de cancro humano multi-centrosomal na mitose. O fenantridina PJ-34 foi a molécula mais potente. Declustering de extra-centrosomes provoca insuficiência mitótico e morte celular em células multi-centrosomal. Cânceres humanos mais sólidos têm alta ocorrência de extra-centrossomas. A actividade de PJ-34 foi documentada em tempo real por imagem confocal de cancro da mama humano vivo MDA-MB-231 transfectadas com vectores que codificam para fluorescente γ-tubulina, que é altamente abundante nos centrossomas e para histona H2B fluorescente presente na os cromossomos. Aberrantes arranjos cromossomos e focos γ-tubulina de-cluster representando centrosomes declustered foram detectados nas transfectadas MDA-MB-231 células após tratamento com PJ-34. Un-cluster extra-centrossomas nos dois pólos do fuso precedeu sua morte celular. Estes resultados ligados for a primeira vez que a atividade citotóxica exclusivo recentemente detectada de PJ-34 em células cancerosas humanas com extra-centrosomes de-agrupamento na mitose e insuficiência mitótico, levando à morte celular. De acordo com descobertas anteriores observados por imagem confocal de células fixas, PJ-34 células cancerosas erradicada exclusivamente com multi-centrosomes sem prejudicar as células normais submetidos a mitose com os dois centrossomas e fusos bi-focal. Esta atividade citotóxica de PJ-34 não foi compartilhada por outros inibidores potentes PARP1, e foi observada em PARP1 deficientes MEF extracentrosomes abrigam, sugerindo a sua independência de PARP1 inibição. Viver de imagem confocal ofereceu uma ferramenta útil para a identificação de novas moléculas células erradicar durante a mitose.

Introdução

Fenantreno derivados inibidores PARP1, incluindo PJ-34, foram projetados para proteger as células quiescentes de morte celular por apoptose induzida pela energia consumindo PARP1 mediada de reparo do DNA sob condições de estresse (acidente vascular cerebral ou infarto do miocárdio) 1. No entanto, recentemente descobrimos que PJ-34, em duas vezes maior concentração do que PARP1 inibição da indução, pode causar exclusivamente morte celular em células cancerosas humanas 2,3. Quanto mais rápida for a proliferação da célula era mais eficiente na erradicação das células era. A atividade citotóxica do PJ-34 foi atribuída a extra-centrosomes de-agrupamento na mitose 2. Muitos humano células cancerosas porto multicentrosomes 4,5. A incubação de células humanas de câncer de mama MDA-MB-231, que abrigam centrosomes supranumerários, com 20 mM PJ-34 eficientemente erradicadas destas células dentro de 72-96 horas, sem prejudicar as células quiescentes ou algumas células em proliferação benigna abrigar dois centrossomas em mitose 2,3. Células benignas incluídas células epiteliais mamárias humanas MCF-10, as células endoteliais humanas (HUVEC) primárias e células mesenquimais preparadas a partir de timo humano. Estas células eram resistentes à actividade citotóxica de PJ-34. PJ-34 não interferiu com o ciclo celular durante 96 horas de incubação ou afetar seus centrossomas e formação eixo bi-focal 2,3.

Montagem centrosome Bipolar é crucial para a formação do fuso bipolar na mitose 4,5. Portanto, células com mais de dois centrossomas desenvolveram um mecanismo molecular mal compreendida, agrupando os centrossomas extras em dois pólos 4-9. Falha de montagem bipolar dos seus centrossomas pode causar multipolar distorcida fusos e aberrante cromossomas segregação que prende o ciclo celular em G2 / M de detenção, e leva à morte das células por falha mitótico 4,5. Os mecanismos moleculares subjacentes extra-centrosomes de-agrupamento são intensamente investigadas 10. Compreender este mecanismo de morte permitirá erradicação exclusivos das células cancerosas, poupando os tecidos saudáveis ​​5,10.

Assim, os compostos que activam a morte celular catástrofe mitótica oferecer um novo modo de tratamento de um cancro selectiva, o que pode ser eficaz numa larga gama de resultados cancers.Our sólidos humanos sugerem que a imagem confocal pode ser utilizado para identificar moléculas que afectam extra-centrossomas no agrupamento mitose 2,3, tornando estes compostos câncer alvo candidatos a fármacos.

Nós documentamos a atividade citotóxica do fenantridina PJ-34, verificando células cancerosas humanas fixas e ao vivo (com alta ocorrência de extra-centrossomas na mitose) contra as células normais. Um passo a passo descrição dos procedimentos de imagiologia utilizadas para identificar a actividade citotóxica de PJ-34 em células de cancro humanas estão incluídas a seguir.

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Protocolo

1. Cultura celular Preparação

MDA-MB-231 de células foram adquiridos a partir da ATCC (American Type Culture Collection) e armazenada em azoto líquido.

  1. Semente 10 6 MDA-MB-231 células em 92 mm de diâmetro, uma placa de Petri em 10 ml de meio completo contendo Dulbeco Modified Eagle Médium (DMEM), 10% de soro de cavalo, 1% de L-glutamina, e 1% de Penstrep-Anfotericina B. Permitir células a proliferar até cerca de 80-100% de confluência.
  2. Remover meio de cultura de prato e descarte.
  3. Lava-se a camada de células brevemente com 0,25% (w / v) de solução de tripsina-EDTA para remover todos os vestígios de soro.
  4. Adicionar 2,0 ml de solução de tripsina-EDTA para prato e observar as células por microscópio invertido até a camada de células é disperso (geralmente dentro de 5 a 15 min.)
  5. Adicionar 18 ml de meio de crescimento completo e aspirar suavemente as células com uma pipeta. Transferir para um tubo.
  6. Centrifugar a suspensão de células a 1.200 rpm.
  7. Re-suspender o sedimento celular em 24 ml de cuLTURE médio.
  8. Adicionar 2 ml de suspensão de células a 35 pratos de vidro de fundo mm (cerca de 25% de confluência) e colocar em incubadora (5% CO2, 37 ° C).
  9. Soluções:
    1. Meio Completo para a proliferação de células: DMEM com 10% de FBS, 1% de antibióticos (100 unidades / ml de penicilina G, 100 ug / ml de estreptomicina, a solução de Pen-Strep-ampho) e 2 mM de L-glutamina.
    2. Solução de tripsina-EDTA, com 0,25% de tripsina-EDTA.
  10. Pratos:
    92 milímetros de diâmetro placas de Petri.
    35 mm de diâmetro com poli-D-lisina de vidro revestida de placas de cultura de fundo.

2. Preparação de células para imagem confocal ao vivo

  1. Semente de 2 x 10 5 MDA-MB-231 células em placas de cultura de vidro de fundo em 2 ml de meio completo, como mencionado na seção 1. Quando a cultura de células atinge confluência de 60-70% (cerca de 3-4 x 10 5 células por prato), prossiga com a transfecção.
  2. Transfecção as células com dois plasmídeos Encodção das proteínas de fusão γ-tubulina-GFP (para detecção de fluorescência de centrossomas) e histona-RED (H2b-RED, para a detecção de fluorescência de cromossomas), utilizando o reagente de transfecção lipossómica Jet-PI, seguindo o protocolo de fabricação. Resumidamente, mistura de 2 ug de cada plasmídeo em um tubo com 100 ul de NaCl (150 mM). Misture o reagente de transfecção (100 ul) com 100 ul de NaCl (150 mM) em um segundo tubo, e incubar 5 minutos à temperatura ambiente (RT). Em seguida, combinar as duas soluções, misture (usando vórtice leve) e spin-down. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente.
  3. Durante a incubação da mistura de transfecção, lave as células uma vez com PBS e substituir o meio de células com 2 ml de DMEM morno sem suplementos (37 ° C).
  4. Adicionar cuidadosamente a mistura de transfecção às células em DMEM e em seguida as células voltem para a incubadora (37 ° C, 5% de CO 2) durante 8 horas.
  5. Após 8 horas de incubação, substituir o DMEM com 2 ml de meio completo e incubar as células na incubadora durante 24hr.
  6. 24 horas após a transfecção, o meio de substituir as células com 2 ml de meio completo contendo 20 uM PJ-34.
  7. Incubar as células durante mais 18 horas (37 ° C, 5% de CO 2).
  8. Sujeitar as células a viver imagem confocal por pelo menos 16 horas em câmara de imagem mantendo as células em 5% de CO 2 e 37 ° C.
  9. Paralelamente, examinar a eficácia de transfecção 36 horas após a transfecção por microscopia de fluorescência como segue:
    1. Semente de 2 x 10 5 MDA-MB-231 células em placas de 6 poços contendo uma lamela por poço em 2 ml de meio completo.
    2. Transfectar as células, como mencionado em secções de 2,2-2,5.
    3. 36 horas após a transfecção as células transfectadas fixar montados numa lamela por incubação em metanol: acetona solução fria (1:1), 7 min, -20 ° C.
    4. Aspirar a solução de fixação e deixar a lamela com as células montadas para secar em uma capa química.
    5. Aplicar Prolongar reagente antifade ouro com DAPI e deixe ªlamela e secar no escuro durante 6 horas.
    6. Examine a lâmina sob o microscópio fluorescente e calcular a porcentagem das células transfectadas (sinais vermelho e verde) da população total de células (coloração DNA por DAPI). A percentagem de transfecção desejada é de cerca de 20-40% quando 100-200 células são contadas.

3. Parâmetros técnicos do confocal Configurações do scanner imagens ao vivo

  1. ScanMode XYZT; Pinhole [arejado] 1,00; Zoom 3,5; Resolução de 8 bits; DPSS 561 nm; argônio, laser visível 488 nm; laser He / Ne visível 633 nm; Objetivo HCX PL APO CS 63x 1,40 OIL UV; Abertura numérica 1,4; Velocidade de digitalização de 700 Hz, índice de refração 1,52.
  2. Imagem apresentação 3-D foram preparadas por Imaris imaging software 7.0.

4. Imagem confocal de mitose em células fixas

  1. Semente de 2 x 10 5 MDA-MB-231 células de câncer de mama (ATCC), fibroblastos embrionárias de camundongos normais (MEF), ou PARP1 deficiente MEF (PARP - / -, preparado pelo Dr. Françoise Dantzer) em lamelas de vidro em placas de 6 cavidades em 2 ml de meio completo. As lamelas foram lavadas com etanol a 96%, seguido de lavagem com água estéril DD, secou-se durante 2 horas e colocada em cada poço do prato de 6 poços.
  2. Adicionar PJ-34 (10-30 uM) ao meio e incubar as células durante o tempo necessário (normalmente até 96 horas).
  3. Lavar as lamelas uma vez com PBS (tampão fosfato salino), e fixar as células usando a incubação em metanol arrefecido em gelo: solução de acetona (1:1), 7 min, -20 ° C.
  4. Aspirar a solução fixadora e deixar as lamelas secar ao capuz química (nesta fase, as lamelas podem ser mantidos em -20 ° C durante várias semanas).
  5. Lavar as lamelas uma vez com PBST (PBS suplementado com 0,1% de Tween-20), para permeabilizar as membranas celulares e bloquear as células com 10% de NDS (soro normal de burro) em PBST ('solução de bloqueio ") durante 1 hora à temperatura ambiente.
  6. Incubar as células fixas permeabilizadas com Antibodi primárioes durante 2 horas à temperatura ambiente (para fusos e centrossomas coloração). Os anticorpos são diluídas em solução de bloqueio, como segue: anti-tubulina α (diluição 1:250) e anti-γ tubulina (diluição 1:200). Os anticorpos primários são aplicados como se segue: 100 ul de aplicar (em uma gota) de uma mistura dos anticorpos presentes na solução de bloqueio para cada uma lamela sobre a cobertura da placa de 6 poços (a tampa é de cabeça para baixo). Com cuidado, coloque a lamela sobre a queda de anticorpos, as células semeadas enfrentando a queda. Incubar as lamelas que enfrentam os anticorpos durante 2 horas à temperatura ambiente.
  7. Coloque as lamelas em volta dos poços e lavam as células 3 vezes com PBST. Em seguida, usar o mesmo processo descrito no ponto 4.6 para a marcação de células sobre as lamelas com os anticorpos secundários fluorescentes. Incubar as células nas lamelas de cobertura, com os anticorpos secundários durante 1 hora, temperatura ambiente, no escuro. Os anticorpos são diluídos em solução de bloqueamento como a seguir: Alexa Fluor 488 (diluição 1:1000; verde) e Alexa Fluor 568 (diluição 1:1000;vermelho).
  8. Monte as lamelas utilizando Prolongar reagente antifade ouro com DAPI (para coloração cromossomos) e incubar durante a RT no escuro para secar.
  9. Examine as lamínulas por microscopia confocal.

5. A viabilidade celular medido pela produção de ATP

Produção de ATP é medida por um kit de ensaio de detecção de ATP luminescente.

  1. Semente as células na placa de 96 poços, a aproximadamente 20.000 células em 800 ul de meio, em cada poço. Três poços do branco deve ser utilizado para a determinação da luminescência do meio do fundo.
  2. Prepare a série de diluições padrão de ATP a partir de cerca de 10 uM a 100 uM e manter em gelo.
  3. Adicionar 50 ul de detergente a cada poço e agitar a placa durante 5 minutos, em agitador orbital, a 700 rpm.
  4. Reconstituir cada frasco do "substrato liofilizado 'com 5 ml de" tampão de substrato de' no kit.
  5. Adicionar 50 ul da solução de substrato reconstituído aos poços, e agitara placa por 5 min em agitador orbital, a 700 rpm.
  6. Manter a placa na obscuridade durante 10 min.
  7. Meça luminiscence de cada poço por ELISA leitor de microplacas.

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Resultados

PJ-34 é uma água solúvel estável fenantridina 1 (Figura 1). Os nossos resultados precedentes revelaram a morte celular e de agrupado extra-centrossomas em vários tipos de células cancerosas multi-centrosomal fixas que tenham sido tratados com o PJ-34. Em contraste, a proliferação de células normais não foram prejudicados 2,3. Centrossomas foram identificados por dupla marcação com anticorpos dirigidos contra centrine1 e γ-tubulina nas células extra-centrosomal fixos 2. <...

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Discussão

Moro imagem confocal fornecida uma documentação em tempo real do efeito citotóxico do PJ-34 em células multi-centrosomal vivo durante a mitose (Figura 3 e da informação suplementar). Esta foi a primeira documentação vivo atribuindo a citotoxicidade de PJ-34 em células de cancro humano para centrossomas extras de-agrupamento e da morte celular, o que sugere a indução de morte celular catástrofe mitótica por PJ-34 5-9. Em contraste, clustering bi-focal de centrossomas super-numerários foi obser...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Fontes de financiamento da pesquisa: um fundo comum de empresa da Universidade de Tel Aviv transferência de tecnologia, RAMOT eo Centro-Sheba Medical (M. CA e SI.), ICRF - Câncer israelense fundação de pesquisa (M. CA.) E Fundação Israel ciência ( SI).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
REAGENTS
DMEMInvitrogen (GIBCO)41965 
FBS (Soro fetal bovino)Invitrogen (GIBCO)12657 
Solução Pen-Strep-AmphoBiological Industries, Israel03-033-1B 
L-glutaminaInvitrogen (GIBCO)25030-024 
0,25% Tripsina-EDTAInvitrogen (GIBCO)25200 
Placas de Petri de 92 mmNunc,Thermo scientific150350 
Pratos de cultura com fundo de vidro revestido de poli-D-lisina de 35 mmMatTek Corporation, EUAP35GC-0-14-C 
Kit de teste de detecção de ATP luminescenteAbcamab113849 
NDS (Soro de Burro Normal)Jackson ImmunoResearch017-000-121 
Anticorpo anti-&alfa;-tubulinaSigmaT9026diluição 1:250 (IF)
Anticorpo anti-letama;-tubulinaSigmaT5192diluição 1:200 (IF)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgGInvitrogenA-11017diluição 1:1.000 (IF)
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgGInvitrogenA-10042diluição 1:1.000 (IF)
Reagente antidesbotamento ProLong Gold com DAPI (montagem)InvitrogenP36935 
JetPEI (reagente de transfecção lipossomal)Polyplus101-10 
EQUIPMENT
Microscópio confocalLeica (Mannheim, Alemanha)TCS SP5II 

Referências

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