Descreve-se o fabrico de peletes de hormonas comprimidos, bem como a implantação cirúrgica subcutânea em ratos. Esta estratégia pode ser combinado com o crescimento de células e de tecidos de xenoenxertos sob a cápsula renal de ratinhos nus atímicos para avaliar a carcinogénese hormonal e regulação do crescimento benigno da próstata.
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Artigo de método
Renal Capsule xeno e subcutânea Pellet Implantação de Avaliação de próstata Carcinogênese e hiperplasia benigna da próstata
Neste artigo
Resumo
Resumo
Novas terapias para duas doenças comuns da próstata, o cancro da próstata (AEP) e hiperplasia benigna da próstata (HBP), dependem criticamente experimentos avaliando sua regulação hormonal. Os hormônios sexuais esteróides (nomeadamente andrógenos e estrógenos) são importantes na AEP e BPH, nós sondar os seus respectivos papéis na indução do crescimento da próstata e carcinogênese em ratos com experimentos usando pelotas hormonais compactados. Hormonais e / ou drogas pellets são facilmente fabricado com uma imprensa da pelota, e cirurgicamente implantadas no tecido subcutâneo do hospedeiro macho mouse. Descrevemos também um protocolo para a avaliação da carcinogênese hormonal combinando subcutânea implantação hormônio pellet com xeno de recombinantes células da próstata sob a cápsula renal de ratos imunocomprometidos. Além disso, o hormônio subcutâneo pellet implantação, em combinação com xeno cápsula renal de tecido de BPH, é útil para compreender melhor regulação hormonal de prost benignocomeu o crescimento, e para testar novas terapias dirigidas sexo esteróide vias hormonais.
Introdução
O câncer de próstata (AEP) e hiperplasia prostática benigna (BPH) são encargos significativos para a saúde. AEP é o segundo câncer de órgão sólido mais prevalente em homens e uma das principais causas de câncer relacionados com a morte 1. HBP também é altamente prevalente entre os homens mais velhos, e estima-se que a manifestação clínica da HBP, os sintomas do trato urinário inferior (LUTS), vai afetar 50-90% dos homens 2. Enquanto andrógenos e estrógenos são conhecidos por serem importantes na AEP e BPH, a nossa compreensão dos mecanismos hormonais que sustentam a carcinogênese e crescimento permanece incompleta 3,4. Modelos animais geneticamente simples e tratável sustentar os estudos que irão abordar estas prioridades em pesquisa de próstata. Em doenças responsivas hormonais como AEP e BPH, o uso da via subcutânea, pelotas de hormônios de liberação lenta, de forma isolada ou em combinação com renal xeno cápsula (a transferência de células, tecidos ou órgãos de uma espécie para outra) na immunocomphospedeiro romised mouse, fornece um método simples e reprodutível para o estudo de regulação hormonal do crescimento e carcinogênese.
A implantação subcutânea hormônio pellet é uma técnica simples e reprodutível para estudar regulação hormonal da carcinogênese e do crescimento benigno na próstata 5. A implantação subcutânea de ratinhos macho adulto com 25 mg de testosterona (T) e 2,5 mg de 17β-estradiol (E2), provoca um aumento no soro e 2 e decréscimo gradual em T, recriando o ambiente hormonal dinâmica de homens idosos 5,6. Além disso, este modelo recapitula muitas das características clínicas da HPB-LUTS 5,7. Métodos alternativos de administração de hormônios incluem a administração oral / gavage ou injeção intraperitoneal, que causam sofrimento ao roedor, são menos consistentes no fornecimento da mesma quantidade de droga ao longo do tempo, e são mais do que um implante cirúrgico de um tempo de trabalho intensivo. Outros modos para subcutâneas hormone e / ou a entrega da droga incluem cápsulas Silastic 8. Enquanto nós também temos experiência com o uso de cápsulas de Silastic, pelotas comprimidas são favorecidos pela sua facilidade de uso e reprodutibilidade. Além disso, as taxas de liberação de hormônio de pelotas comprimidas melhor imitar os rácios de esteróides sexuais dinâmicas hormonais observados nos homens idosos 5,7.
Desde o desenvolvimento de ratinhos geneticamente imunocomprometidos, numerosos sistemas modelo in vivo incorporando técnicas xeno ter sido desenvolvido para o estudo de uma ampla variedade de tecidos normais e doentes. Existem várias categorias de base do xeno. Xenoenxertos de tecidos consistem de um pequeno pedaço de tecido intacto, o que pode ser uma estrutura normal, tumor maligno ou benigno do crescimento. Szot et al. (2007), recentemente iluminada xeno cápsula renal de ilhotas pancreáticas 9. Aamdal et al. (1985) descreveu xeno cápsula renal de 27 linhas celulares de cancro humano em imrato munocompromised hospeda 10. Enxertos também pode ser composto por uma única linha de células imortalizada (canceroso ou não tumorigénico), ou pode consistir de uma linha de células imortalizada combinada com células isoladas a partir de mesênquima (enxerto de células recombinante).
Somos a favor de xeno de recombinantes células para investigar os respectivos papéis do estroma e epitélio no desenvolvimento da AEP e BPH. Cunha et al. (1980) foi o primeiro a relatar que quando adulto murino epitélio da bexiga é combinado com mesênquima embrionário seio urogenital (UGM) e xenoenxertados sob a cápsula renal de ratos hospedeiros machos, o tecido se desenvolve em estruturas semelhantes a ácinos próstata 11. Norman et al. (1986) mostraram que ratinhos adultos ductal da próstata e epitélio UGM, quando combinados em recombinantes de tecido, são submetidos a um crescimento e ramificação ductal morfogénese 12. Hayward et al. (1988) mostrou que o epitélio da próstata humano responde a indutivos m fetalesenchyme de uma forma semelhante 13. Um modelo de carcinogénese hormonal na próstata, ao combinar a linha de células epiteliais imortalizadas da próstata humana BPH-1 com UGM, foi relatado pela primeira vez por 14 Wang et al. (2001) e tem sido amplamente utilizado no nosso laboratório 15. Este modelo é bem adequado para a compreensão progressão PRCA porque epitélio benigna da próstata se transforma em doença metastática, modelagem avançada PRCA em humanos 5. Como os componentes específicos podem ser geneticamente manipulados, enxertia de células recombinante é particularmente útil como uma abordagem para avaliar as interacções de estroma-epitelial.
Outros locais adequados para xeno são intradérmica, subcutânea e locais ortotópico 16. Dependendo do processo de tecidos e doença de interesse, estes podem ser abordagens alternativas adequadas. Para o estudo da carcinogênese hormonal da próstata e regulação do crescimento benigno, escolhemos a cápsula renalsite para xeno devido às suas maiores enxerto tomar forma, o fornecimento de sangue abundante e capacidade de implantar um maior número de enxertos em um local confinado 16. Além disso, a manipulação hormonal do ratinho hospedeiro que resulta em atrofia prostática limita o uso da próstata enxerto ortotópico 16.
Este protocolo descreve técnicas de fabrico comprimido hormona / droga sedimento e a implantação cirúrgica, bem como xeno cápsula renal de células da próstata humana e tecido de enxertos. Em conjunto, estas técnicas proporcionam um ensaio sensível para determinar se um rato geneticamente modificado é mais susceptível a PRCA e / ou de iniciação BPH do que as estirpes de controlo. Xeno é uma técnica poderosa para a avaliação in vivo do potencial de células experimentais para o desenvolvimento histológica e as características moleculares de malignidade, bem como um ensaio para novas estratégias de tratamento para uma grande variedade de doenças benignas e malignas.
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Protocolo
1. Preparação do comprimido hormonal / Drogas Pellet
- Este procedimento deve ser feito em uma capa de segurança química, enquanto vestindo um casaco de laboratório, luvas, máscara, óculos de segurança, e capô. Para evitar a contaminação cruzada, é essencial que o equipamento de fabricação sedimento é cuidadosamente limpa com etanol a 70% antes e depois do fabrico de cada tipo de sedimento.
- Usando uma balança analítica e pesar papel, medir a quantidade desejada de pó de hormônio / drogas. Cerca de 5% de material adicional é recomendado para acomodar a perda durante a prensagem.
- Algumas hormonas e / ou drogas requer um agente de ligação ou de enchimento, que é misturada antes da pelota fabrico. Por exemplo, para a fabricação de um 2,5 mg de pelotas de 17β-estradiol, combinar a hormona com 22,5 mg de colesterol, o que resulta em um 25 mg de pelotas.
- Transferir cuidadosamente em conjunto morrer, lugar sob a imprensa e empurre a alavanca firmemente para baixo para comprimir pelota. Use pressão consistente para manter a superfície constante sãoum em relação ao volume.
- Próxima reverter o suporte da matriz e empurre a alavanca para baixo novamente para liberar o sedimento.
- Inspecione pelota para a integridade e determinar se massa final está dentro da faixa desejada. Um intervalo aceitável é uma diferença de ± 5% da massa final (por exemplo, uma gama aceitável para uma pastilha de 25 mg é 23,8-26,3 mg).
- Pelotas pode ser feita antes da cirurgia e armazenado (condições e tempo de armazenamento depende da estabilidade do hormônio ou medicamento usado na fabricação de pelotas). Pelotas de hormônio pode ser comprado como uma alternativa para agregar fabricação. Adquirindo pelotas evita o uso de drogas da classe não-farmacêuticas, uma vez que serão formuladas e agravado.
2. Preparação de células recombinantes Xenoenxertos
- Colheita e cultura primária rato mesenchyme urogenital (UGM) células estromais para menos de 4 semanas antes de ser recolhida para a contagem.
- Cultura imortalizado próstata linhagens de células epiteliais no fash habitualíon e recolher para a contagem. Para este exemplo, preparar os enxertos de células recombinantes por mistura de 100.000 células BPH-1 epiteliais por enxerto com 250.000 células estromais UGM por enxerto em suspensão.
- Células de pellets em conjunto e re-suspender o suficiente colágeno tipo neutralizado 1 cauda de rato para fazer número desejado de enxertos, cada um em um volume de 25 mL a 50 mL.
- Definir enxertos recombinantes a 37 ° C durante 15 minutos e, em seguida cobrir com meio de crescimento durante o armazenamento a 37 ° C durante até 48 horas antes da enxertia.
3. Preparação de xenoenxertos de tecidos
- Manter precauções universais para patógenos transmitidos pelo sangue durante a colheita de tecidos e procedimento cirúrgico. Após aprovação do conselho de revisão institucional e consentimento informado, obter o tecido da próstata fresco de ressecção cirúrgica. Para estudos de crescimento HBP, os tecidos podem ser colhidos a partir de ressecção transuretral da próstata ou procedimentos de prostatectomia simples. Xenografts primárias da AEP ou prost benignoComeram tecido pode ser obtida a partir de amostras de prostatectomia radical.
- Loja colhido tecido em mídia isotônicas buffer celulares ou soro fisiológico no gelo. Dependendo das condições do tecido e armazenamento, as amostras podem ser armazenadas até 24 horas antes da preparação de enxertos de tecidos. A prática comum é dividir a amostra em três partes, com uma seção fixa em formalina e processados rotineiramente para histologia, uma peça congeladas rapidamente para análise molecular e uma peça dividida em enxertos de tecido (1-3 mm de tamanho).
4. Preparação de fogo polido vidro Pipeta
- Luvas resistentes a usar óculos de protecção, bata de laboratório e de calor, lugar de vidro Pasteur pipeta ponta em bico de Bunsen chama em um ângulo de aproximadamente 60 ° para começar.
- Manter um, um ligeiro movimento constante para a pipeta, de modo a evitar pontos quentes.
- Desenhe a ponta fina e fogo-polonês com o objetivo de ser um final ligeiramente curvo com um arredondado, ponta fechada.
5. Preparação de Instrumentos e centro cirúrgico
- Autoclave todos os instrumentos. Antes da cirurgia, inspecionar todos os instrumentos, tendo o cuidado de manter o campo estéril.
- Configure área cirúrgica esterilizada com absorventes, o escopo de dissecação, anestesia nariz cone, instrumentos cirúrgicos e lâmpada de aquecimento direcionado para a área de trabalho. Para esterilizar ferramentas entre ratos, Pré-aquecer esterilizador talão.
- Montar e aparelho de anestesia teste; pesar limpador de gás.
- Usando as microondas, pastilhas de cera de calor por até 5 minutos (em incrementos de 1 min, amassar o bloco de cera, a fim de combinar derretido e unmelted cera) em 70-80% de energia, até que toda a cera é derretida uniformemente. Ao toque, garantir a almofada não está muito quente e colocar sob a gaiola de recuperação roedor vazio.
- Don equipamento de protecção individual para procedimentos cirúrgicos de roedores, incluindo máscara cirúrgica, gorro, luvas e bata.
6. Procedimento cirúrgico: Renal Capsule xeno
- Todos os procedimentos que envolvam animais de pesquisa deve ser feita com a aprovação de cuidados de animais de uso institucional e comitês. Antes da indução da anestesia, observar o mouse para garantir a saúde e bem-estar.
- Posicione o mouse na câmara de indução da anestesia isoflurano em 3-5%. Quando o animal parou de se mover e freqüência respiratória diminuiu, a transferência para o nariz cone na posição prona, e manter a anestesia em 1-3%.
- Se necessário, use tesouras para raspar a parte de trás do mouse. Isso não é necessário quando se utiliza nuas (nu / nu) ratos atímicos.
- Aplique uma pressão firme para o cinto da pata traseira estendida para avaliar a adequação da anestesia. Se o mouse responde à pressão, é necessário mais tempo para a anestesia fazer efeito. Se necessário, ajustar o fluxo anestesia ligeiramente para atingir anestesia adequada.
- Quando o mouse está devidamente anestesiados, desinfete o local da cirurgia com a solução (Betadine) iodo cirúrgico seguido de70% de álcool.
- Don luvas estéreis e vestido; aplicar campos estéreis para o local da cirurgia. Levante a pele para trás com um par de pinças dentadas, e usar a tesoura grosseiros fazer um 2-3 cm dorsal incisão mediana.
- Utilizando uma tesoura sem corte ou uma sonda, separar a derme subjacente a partir da parede do corpo (em ambos os lados da incisão para enxertos bilaterais ou de um lado para o enxerto unilateral).
- Reposicionar o mouse para a posição lateral, e identificar a localização do rim, visualizando o perfil renal através da parede muscular. Aplicando pressão manual suave com o polegar eo dedo indicador no abdômen pode ajudar com a visualização de órgãos internos.
- Com uma tesoura de íris finos, e tendo o cuidado de evitar grandes vasos e nervos espinhais, fazer uma incisão de 1 cm na parede do corpo paralelo à coluna vertebral. Ampliar esta incisão para 1,5-2,0 cm (um pouco mais do que o longo eixo do rim), abrindo delicadamente a tesoura mais amplo depois de colocá-los na incisão inicial.
- Exteriorizar o rim através da aplicação de uma leve pressão do lado de fora da parede do músculo em cada lado do rim com o dedo indicador e polegar. Tuck as bordas da pele abaixo do rim exteriorizada, que vai descansar na parede do corpo. Embora o rim é exteriorizado, manter a hidratação da cápsula renal através da aplicação de solução salina estéril.
- Usando finas # 5 fórceps levante cuidadosamente a cápsula renal do parênquima do rim e com um bom bisturi, faça uma incisão de 2 mm -4 na cápsula. O tamanho da incisão é determinado pelo tamanho do enxerto, mas deve ser minimizada, a fim de manter a integridade da cápsula.
- Manipular uma pipeta de Pasteur de vidro, que foi desenhada e fina-fogo polido com uma extremidade fechada arredondada sob a cápsula tangencial à superfície do rim. Abra cuidadosamente uma pequena bolsa cápsula para os enxertos, utilizando muito cuidado para não danificar o parênquima renal.
- A orla de corte da cápsula renal é levantado com a pinça fina, e o i enxertos inseridas na bolsa, sob a cápsula com o vidro pipeta polida ao fogo. Diversos enxertos podem ser colocados sob a cápsula do rim e uniformemente espaçados na superfície do rim.
- Se, durante o curso de enxertia, a cápsula fica desidratado, ele deve ser humedecido por aplicação de solução salina estéril.
- Quando enxertia está completa, elevar ligeiramente os lados da incisão da parede muscular para substituir o rim de volta para dentro da cavidade do corpo. Observa-se que os enxertos não escorregar para fora de debaixo da cápsula.
- Feche a parede do músculo com uma única sutura (4-0, FS-2 vicryl sutura). O procedimento cirúrgico pode ser repetido no rim contralateral reposicionando o mouse.
- Quando enxerto estiver concluída, o mouse pode sofrer implantação pellet subcutânea durante o mesmo procedimento cirúrgico (Veja Protocolo passo 7).
- Utilizando uma pinça dentada, alinhe as bordas da lesão de pele e aplicar 2-3 clips ferida cirúrgica para fechar a incisão. Administrar analgesia (usamos 5-10 mg / kg carprofen usando uma injeção subcutânea) e coloque o mouse na posição de decúbito lateral na gaiola de recuperação. Assegurar a manutenção da temperatura do corpo com o calor de uma lâmpada ou uma almofada de aquecimento. Observar para a recuperação total do mouse, o que deve ocorrer em menos de 15 minutos.
- Ratos devem ser observados para o próximo 24 horas por sinais de dor pós-operatória, sangramento e / ou outras complicações. Inspecione regularmente incisão cirúrgica para sinais de infecção.
- Remover clips ferida com dispositivo cirúrgico remoção ferida clipe 7-14 dias após a cirurgia.
7. Procedimento cirúrgico: subcutânea Pellet Implantação
- Repita os passos de 6,1-6,5 de cápsula renal xeno procedimento cirúrgico.
- Levante a pele para trás com um par de fórceps de pele, e usar a tesoura grosseiros fazer um 1-2 cm dorsal incisão mediana.
- Utilizando uma tesoura sem corte ou uma sonda, separar a derme subjacente a partir da parede do corpo numa direcção craniana.
- Usando fórceps da pele,levantar delicadamente o aspecto cranial da incisão na pele, e segurando a pelota hormônio delicadamente com uma pinça, serrilhadas retas, insira o pellet e solte na nuca, no bolso que você criou com a sonda sem corte.
- Repita os passos de 6,18-6,20 cápsula renal xeno procedimento cirúrgico. Se estiver executando a implantação subcutânea pellet só, use um clipe de ferida cirúrgica para fechar a incisão cirúrgica.
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Resultados
Dependendo da hipótese de ser testado, xeno cápsula renal de tecido ou de células recombinantes pode ser realizada isoladamente ou em combinação com a implantação subcutânea hormona sedimento. Um diagrama esquemático de um experimento hipotético combinando renal experimento cápsula xeno com hormona subcutânea sedimento implante está ilustrada na Figura 1. Uma variedade de substâncias em pó e / ou cristalinos pode ser usado no fabrico de granulados compactados com o pellet press. Figura 2
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Discussão
Este papel e o protocolo delineado aqui descrever o fabrico de hormona comprimido e / ou peletes de droga, e o procedimento cirúrgico para a implantação da pelete de camundongos. Dependendo da questão de pesquisa para ser dirigida, esta técnica pode ser realizada isoladamente ou em combinação com xeno cápsula renal de células de próstata enxertos recombinantes ou xenoenxertos de tecidos da próstata, os quais são amplamente usados em técnicas de pesquisa de próstata 17-19. Tomadas em conjunto, essas técnicas...
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a todos os membros do laboratório Ricke, passado e presente. Agradecemos Calvin Patten, Jr., DVM e Brigitte Raabe, DVM, pelos comentários úteis sobre o protocolo. Gostaríamos de agradecer o NIDDK, NCI e NIEHS pelo apoio financeiro para estes estudos: R01DK093690, R01CA123199, RC2ESO18764. TMN é um estagiário no Programa de Formação do Cientista Médico da Universidade de Rochester financiado pelo NIH T32 GM07356, o NIH sob Ruth L. Kirschstein Nacional Research Service Award F30DK093173 também apóia este projeto. CDV é suportado por T32CA157322 e ABT é suportado por T32ES007015 na Universidade de Wisconsin-Madison. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais ou NIH.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Prensa de pellets | PARR Industries | 2815 | 3mm Punch & Conjunto de matrizes |
| Balança Analítica | Ohaus | 1918302 | Voyager ou outro |
| bico de Bunsen | Fisher Scientific | 03-962Q | |
| Microscópio de dissecação | Leica | L2 | |
| Deltaphase Pad Kit (cera reaquecível) | Braintree Scientific | 39DP | Alternativa a uma almofada de aquecimento elétrica |
| Esterilizador de esferas quentes | F.S.T.18000-45 | ||
| Vaporizador de isoflurano | Supera Anestesia Innov | VAP3000 | |
| Câmara de Indução | Supera Anestesia Innov | RES644 | |
| F / AIR Canister | Supera Anestesia Innov | 80120 | |
| Manifold de 4 portas | Supera Anestesia Innov | RES536 | |
| Circuitos de Rerespiração | Supera Anestesia Innov | CIR529 | |
| Conexões de entrada / saída | Supera Anestesia Innov | VAP203 / 4 | |
| Pressão Reg / Gauge | Supera Anestesia Innov | OXY508 | |
| Medidor de vazão de oxigênio | Supera Anestesia Innov | OXY660 | |
| 21mm Tubo transparente Supera | Anestesia Innov | 301-150 | |
| Cone de nariz de camundongos pequenos | Supera Anestesia Innov | ACC526 | |
| Bata cirúrgica estéril | Midwest Vet Supply | 350.79866.2 | |
| Máscara cirúrgica | Midwest Vet Supply | 350.50111.2 | 2 camadas com ganchos |
| de orelha Gaze estéril | Midwest Vet Supply | 001.14100.2 | 2 x 2 polegadas |
| Luvas estéreis | Kimberly Clark | 55092 | |
| Bouffant | Midwest Vet Supply | 001.27100.2 | |
| Aplicador de Ponta de Algodão | Midwest Vet Supply | 001.06220.2 | |
| Lavagem Cirúrgica | Midwest Vet Supply | 733.80010.3 | |
| Campos Estéreis (Fenestrados) | General Econopak, Inc | 88VCSTF | |
| REAGENTS | |||
| Colesterol | Sigma-Aldrich | C-3292 | |
| Testosterona Proprionate | Sigma-Aldrich | T-1875 | |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E-2758 | |
| Isoflurane | Midwest Vet Supply | 193.33161.3 | |
| Carprofeno | Midwest Vet Supply | 193.70200.3 | Injetável (Rimadyl) |
| Betadine | Webster Veterinary | 07-836-3379 | |
| Solução salina estéril | Midwest Vet Fornecimento | 193.74504.3 | NaCl 0.9%, Injetável |
| INSTRUMENTOS CIRÚRGICOS | |||
| Tesoura Afiada/Cega Reta | Científicas Finas (FST) | 14054-13 | |
| Pinça Graefe (Serrilhada, Dentada, Curva) | F.S.T. | 11055-10 | |
| Tesoura de íris fina | F.S.T. | 14090-09 | |
| Graefe Bisturi | F.S.T. | 10071-12 | |
| Dumont #5 fórceps | F.S.T. | 11251-20 | |
| Pipetas de vidro Pasteur | Fisher Scientific | S67050 | 5" comprimento |
| Graefe fórceps (serrilhado, curvo) | F.S.T. | 11052-10 | |
| Pinça Graefe (Serrilhada, Reta) | F.S.T. | 11050-10 | |
| Vicryl Suture | Midwest Vet Supply | 295-92100.2 | 4-0, FS-2, Suporte de Agulha Absorvível |
| com ação de tesoura | F.S.T. | ||
| Clipes de Ferida | Braintree Scientific | ACS CS | Pode usar clipes de 7mm ou 9mm |
| Clipper de Ferida Reflexo | F.S.T. | 12031-09 | Corresponde com tamanho do clipe enrolado |
| Removedor de Clipe | F.S.T. | 12033-00 | de |
| Esterilização | FST | 20810-01 | Qualquer recipiente autoclavável servirá |
| Seringa com agulha | BD | 148292C | 1cc, 25Gx1 |
| Aplicador de Brincos | National Band Tag Co. | 1005s1 | Alternativa para entalhar orelhas |
| pequenos animais Ear Tags | National Band Tag Co. | 1005-1 |
Referências
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Reimpressões e permissões
